膜蛋白结构动力学（科学出版社十三五普通高等教育本科规划教材）

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**章 膜蛋白
　　半亩方塘一鉴开，天光云影共徘徊。问渠那得清如许，为有源头活水来。
　　——朱熹，《观书有感》
　　膜蛋白在细胞的跨膜物质转运、能量转化、信息传导、膜稳态维持等方面发挥着不可替代的作用。
　　是什么物理因素使膜蛋白分子区别于可溶性蛋白分子呢？膜蛋白分子具有哪些共性的结构特征呢？
　　本章将讨论膜蛋白的重要性及其分类。概括地说，存在两类主要的膜蛋白分子，即α螺旋（α-helix）束型和β桶（β-barrel）型。因为绝大多数功能性膜蛋白分子属于α螺旋束型并且将在后续各章中较详细地予以介绍，所以本章用一小节以β桶型膜蛋白为实例对膜蛋白分子的折叠过程和稳定性进行讨论。
　　关键概念：整合型膜蛋白；功能性膜蛋白；膜蛋白分子组装
　　1.1 生物膜与膜蛋白
　　生命进化至今已经历了逾40亿年的漫长历史（图1.1.1）。大约35亿年前，地球上出现了**批原始细胞，正式拉开了生物圈（biosphere）与岩石圈和海洋圈分离过程的大幕［1］，开启了长达20多亿年由原核细胞主宰生命世界的时期。直到约12亿年前，发生了一件重塑生物圈的重大事件——细菌在古细菌中的内共生，即出现了**代真核细胞，也就是细胞内部还嵌套生物膜的系统。在生物圈形成的最初20亿～30亿年，生命世界进化出了在我们今天看似精巧得难以置信的分子机器、生化通路和网络系统，为其后多细胞生命现象在地球上的繁荣（包括我们人类的出现）奠定了基础。设想一下，没有生物膜的生物圈会是怎样的一个混沌世界？它仍然滞留在其原始阶段，表现为一些发生于水中和岩石缝隙的、缺乏时空关联的化学反应。生物膜不仅为细胞提供了一层物理边界，它的横空出世也在原始生物圈与现代生命形式之间划出了一道鸿沟。
　　那么，本书的主角——膜蛋白，在生物圈中发挥着怎样的作用呢？细胞不是一个热力学的封闭系统，它需要持续地与外界交换物质、能量和信息，以维持远离热力学平衡态的准稳态。这些交换和转化功能主要是由膜蛋白领衔完成的。要理解细胞和细胞以上层次的生命现象，就不可能不涉及膜蛋白分子的结构和功能，也就是膜蛋白的结构动力学。另外，由于承载着诸多早期生命世界中就已经出现的诸如营养摄取、能量转化、环境感知等基本生物学功能，膜蛋白可以被视为我们认识生命进化的活化石。众若繁星的膜蛋白分子是如何在进化中获得了今天看似精巧绝伦的结构呢？它们的工作原理真的是像人们娓娓道来的那样千人千面，罕有共性可循吗？为了解答这类问题，我们需要研究膜蛋白的结构与功能之间的动力学关系，包括膜蛋白分子如何在自由能a驱动下实现其存在的生物学意义。
　　细胞、生物膜和膜蛋白分子之间有着怎样的几何关系呢？假如我们将细胞放大到西瓜的大小（直径比10μm∶0.3m），生物膜也只不过是A4纸一般的一层外皮（厚度比5nm∶0.1mm），其表面上点缀着各种各样、小米粒般大小的各类膜蛋白分子。在大多数情况下，膜蛋白仅占据着很小的膜表面（＜5%）。可能有读者会提出疑问：生物化学教科书中不是宣称生物膜干重的50%来自蛋白质吗？在后面膜蛋白的分类中我们将看到，这些蛋白质分子并非都是直接、完全地镶嵌在脂双层（lipid bilayer）中的。因此，它们并不依照质量成比例地占据膜的表面。
　　除了完成生物膜两侧的物质、能量和信息的传输，即所谓选择性通透，膜蛋白还担负着生物膜的合成、稳态维持等任务，并且参与细胞之间及膜被细胞器之间的相互作用，等等。许多膜蛋白分子或者其复合体，与膜蛋白的折叠、组装、修饰，以及膜生成或者细胞器生成直接相关（图1.1.2）。毋庸置疑，从生物膜嵌入生物圈的那一刻起，膜蛋白与生物膜就相互依存，互以对方为自身存在的必要前提。尽管早期的膜蛋白不可避免地带有粗糙、易损、多变等原始特征，它们依然顽强地履行着生物圈所赋予的使命。
　　为了解释蛋白质分子与生物膜的结构关系，辛格（S. Jonathan Singer）和尼科尔森（Garth Nicolson）于1972年提出了膜蛋白在生物膜中的液态镶嵌模型（.uid mosaic model；图1.1.3）［2］。该模型的要点之一是膜蛋白分子镶嵌在可流动的脂双层中，并且脂分子和膜蛋白分子都不断地发生着二维自由扩散。随着对生物膜研究的不断深入，今天人们已经认识到，膜蛋白分子并非悠闲地游荡在脂双层中的、一颗颗孤立的刚性橄榄球。这些蛋白质分子不仅持续发生着相对于脂双层的位移、转动和振动等类型的热运动，而且其分子内部以及分子之间还不断地进行着多种构象转换。同时，脂双层也为膜蛋白提供了一方发挥功能的舞台，并且主动地影响着膜蛋白分子的性质和功能。
　　1.2 细胞能量系统的“三驾马车”
　　在行使其功能时，绝大多数功能性膜蛋白分子需要能量来驱动。生命细胞中普遍存在着三大能量系统（图1.2.1）［1］：①氧化还原电势；②以腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）为代表的含有“高能”磷酸键的不稳定分子；③跨膜电化学势。它们分别类比于宏观世界中具有较高能量质量比的储能物质、便携式通用电池，以及网络覆盖式动力电网。三者彼此相互转化，维持着某种动态平衡；同时，也各自进化出独特的应用领域。氧化还原能量常常被用于生物小分子（包括ATP）的合成。ATP是生物大分子多聚化的必要前提；从进化的角度来看，ATP的出现是生物圈由小分子世界向大分子世界转变的分水岭。而跨膜电化学势则为细胞提供跨膜信号转导和物质转运所需要的驱动力。本书将较为详细地讨论各类跨膜电化学势相关过程。在第七章中我们将看到，在细胞三大能量系统之间的能量转化过程中，膜蛋白发挥着不可替代的作用。
　　三大能量形式的共性在于它们均涉及静电相互作用；同时，它们又各自具有其独特的物理化学基础。化学中两个最基本的反应类型——氧化还原反应和酸碱反应，分别涉及电子和质子的转移。由于水分子本身不具备稳定的外层电子空轨道，无法接收和传递电子，因此水溶液属于电子的不良导体。因此，氧化还原电势可以不依赖生物膜而稳定地存在，表现为电子在特定的电子供体与受体化合物之间所形成的结合能差。电子的定向迁移正是由反应物之间的此类氧化还原电势能差驱动的。由于电子的负电性质，并且电荷与电压的乘积具有能量量纲，氧化还原电势能经常用氧化还原电位来表示。在没有外界能量输入的情况下，电子只可能自发地从具有较低氧化还原电位的化合物向较高氧化还原电位的化合物迁移。氧化还原反应的这些性质使其成为生物圈的原始推动力。在蛋白质（复合体）内部，电子长程转移的路径往往借助于具有非局域化电子结构的共轭键系统，如金属簇、芳香环侧链基团或者杂环辅因子等。另外，由于氧化还原反应涉及电荷迁移，一个给定基团的氧化还原电势必然受到环境电场的影响。譬如，正电性的外来电势场将提升该基团的氧化还原电势，使其成为更强的电子受体，同时弱化其作为电子供体的能力。当一对氧化还原反应的供体和受体同时受到均匀外电场的等强度影响时，上述效应可以忽略；相反，假如外电场选择性地影响两者之一，氧化还原反应的速率将受到调制。这一论点对于理解后文（如第七章）中氧化还原电势向跨膜电化学势的转化十分重要。
　　与电子相反，水溶液表现为优良的质子导体。这是因为水分子中的氧原子具有外层sp3杂化轨道，即正四面体配位方式；后者在结合了两个质子之后仍然可以接受另一个“多余”的质子，而不出现明显的静电排斥现象。事实上，在水中自由质子的浓度极低，质子主要以水合质子（H3O＋）的形式存在；这与水分子本身的高摩尔浓度（56mol/L）有关。此外，相邻的水分子极易形成动态的格罗图斯质子导线（Grotthuss proton wire），即在氧原子位置维持相对不变的前提下，质子发生快速的接力式迁移的路径。因此，质子电化学势在水溶液中难以稳定存在，而只能借助生物膜来实现。质子定向运动的驱动力来自质子化学势和外界电场两部分。在自由扩散的情况下，化学势由浓度梯度决定；而在蛋白质内部的非自由扩散情况下，化学势由质子供体基团与受体基团之间的亲和力差别（相对亲和力.pKa）决定。值得强调的是，正是生物膜系统的存在，使各类跨膜电化学势的出现成为可能，从而大大提高了细胞中能量转化的综合效率，即速率与效率之间的平衡优化；进而，也使物质、能量和信息在细胞中的流动和非均匀的空间分布得以在更为有序的方式中实现。本质上，生物膜的出现及其所衍生出的跨膜电化学势使一类“全新”的物理能量形式——介观静电能进入了生命能源的主角之列。
　　与上文中相对亲和力.pKa有关，我们需要定义绝对质子亲和力pKab，即当给定基团（X）发生50%质子化时环境的pH。pKa越高表示X基团获取质子的能力越强。伴随质子从水溶液到X基团的迁移，.pKa为pKa－pH。.pKa越大，X基团发生质子化的概率越高。一般而言，人们只讨论所谓**质子化的pKa。譬如，碱性残基Arg的**质子化pKa极高（取值13.6），表明Arg侧链可以稳定地结合一个质子；即使水溶液中质子极度稀缺，这个质子也很难解离。然而，由于胍基电子轨道的平面性以及静斥作用，在Arg＋基础上发生第二次质子化（形成Arg2＋）的可能性微乎其微，也就是说Arg＋基团的pKa极小。与电子供体或受体的氧化还原电势类似，pKa并非X基团的特征常数，而是一个极易受环境影响的可变参数［3］。譬如，邻近基团Y的质子化将通过静电排斥力降低X基团的pKa，从而妨碍X基团从环境中进一步获取质子。但是，Y基团的质子化与否并不影响质子由Y到X的迁移潜能（.pKa）。我们将会看到，作为一个实验可测量物理量和本书中被大量反复使用的概念，.pKa与自由能差直接相关。进而，溶液环境与膜蛋白内部的微环境相比，包括酸性氨基酸、组氨酸、半胱氨酸在内的可质子化反应的氨基酸残基，其pKa可能发生显著的变化。譬如，在膜蛋白内部，酸性氨基酸残基的pKa可能升高到中性pH以上（例如，据推测，细菌视紫红质蛋白中质子通路上的关键氨基酸残基Asp96的pKa甚至可以高达11）［4］；而某些组氨酸残基的pKa却有可能从pH 7.6降低到6.0以下［5］。此外，各类带电基团也可以通过氢键网络参与结合水分子或者水合质子，从而形成质子导线。从结构生物学角度讲，高分辨率、单颗粒冷冻电子显微镜成像技术（单颗粒冷冻电镜技术）为判断一个酸性氨基酸残基是否已发生质子化，从而在电负性和电中性之间变化，提供了一种全新的、直接的、可视化实验手段［6，7］。
　　ATP所代表的磷酸化能量系统与氧化还原或者质子能量系统之间存在着诸多微妙的相似之处。在磷酸化系统中，无机磷酸根基团（Pi）一般是从相对不稳定的高能态化合物（Pi供体）向更稳定的低能态化合物（Pi受体）自发地进行转移。ATP是最常见的Pi供体，而水分子是最常见的Pi受体。磷酸根基团由ATP向水分子的转移所释放的自由能即ATP的水解能。不难设想，反应物对磷酸根基团的亲和力也可以用一个类似于质子pKa的量加以描述。在生命系统中，不胜枚举的酶可以催化ATP的水解，同时将该水解能偶联到其他需要自由能驱动的化学反应中。
　　从细胞能源的重要性角度来看，膜电位与ATP可谓是不分伯仲。ATP常被视为比跨膜电化学势更为基本的能量储存形式。譬如，人们将由ATP驱动的转运蛋白称为初级主动转运蛋白（primary active transporter），而将由跨膜电化学势驱动的转运蛋白称为二级主动转运蛋白（secondary active transporter）。而实际上，由于三种能量形式之间的动态平衡及转换，上述主次区分带有明显的主观性。此外，人们习惯把跨膜电化学势作为ATP合成流水线的一部分来看待，然而这一观点显然远远低估了前者的重要性。作为细胞的动力网络和信息网络的主干，跨膜电化学势的意义绝不亚于人类发展史上电气化和信息化的辉煌；事实上，相比于人类在200年前实现了依赖电力的第二次工业革命，生物圈利用电能的历史可以回溯到30亿年之前。
　　1.3 膜蛋白的结构研究
　　人类是视