放线菌资源及药物发现/生命科学前沿及应用生物技术

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**章放线菌资源
　　放线菌是自然生态系统的重要组成部分，其生态作用主要有两方面，一是产生各种各样的酶（纤维素酶、糖苷酶、蛋白酶、几丁质酶等），分解难分解的物质；二是产生各种各样的抗菌物质，维持生态系统的平衡。这两类物质都可被人类利用。
　　放线菌是用于生产抗生素等药物最多的一类微生物。美国科学家赛尔曼 A.瓦克斯曼（Selman Abraham Waksman）因从土壤放线菌中发现了链霉素于 1952年获得诺贝尔生理学或医学奖，之后大约 20年的时间里，大量抗生素被发现和应用，抗生素研发处于黄金期。在这之后 63年（2015年），日本科学家大村智（Satoshi ōmura）因其从放线菌中发现的阿维菌素等可作为杀虫剂在全世界大面积应用而获诺贝尔生理学或医学奖，因此有学者认为，这将迎来抗生素开发的又一个黄金期。抗生素对人类健康和农业、畜牧业的贡献无论怎样评价都不为过。放线菌仍然是当今药物开发中最重要的资源之一。
　　但是，抗生素等微生物药物的开发越来越困难。投资大、周期长、风险高，需要多学科密切配合，这些都成为企业难以承受的沉重负担。新上市的微生物新药越来越少。有的新药上市很短时间就产生抗药性。这些都是微生物药物开发面临的困境。
　　当今，放线菌药物开发正处于以代谢组学-超高压高分辨质谱分析为核心，全面利用现代新技术，开拓动物、海洋、沙漠及其他原始环境放线菌研究新领域，发现新药的时期（图 1-1）。
　　图 1-1 放线菌天然药物研究的历程（Polpass and Bhavanath，2016）
　　研究放线菌资源的分布规律，发现新的放线菌资源，是开发利用相关药物的重要组成部分及必要前提之一。
　　云南是我国生物多样性最丰富的地区之一，位于我国西南边陲，东连贵州高原及桂西丘陵，南邻越南、老挝北部低缓丘陵，西接缅甸伊洛瓦底江平原，西北接青藏高原，域内地势由西北向东南呈阶梯式递降，西北的卡格博峰 6740m，而东南边境的河口仅 76m。山脉走向、河流分布等差异极大，我国独特的北南走向山脉横断山就在云南西部，堪称“地质博物馆”。地质地貌和气候植被的复杂性也造就了云南土壤类型的多样性，砖红壤、山地红壤、红棕壤、山地黄棕壤、山地棕壤、棕色暗针叶土、高山草甸土、荒漠土（极少）等不同类型的土壤分布于不同海拔和地区。国家级自然保护区面积很大。这些得天独厚的自然地理环境使得云南土壤微生物资源的分布也错综复杂，为天然产物的开发提供了极其丰富的菌种资源库。
　　本实验室（云南大学云南省微生物研究所放线菌实验室）自 20世纪七八十年代开始对云南不同生态环境的放线菌资源进行研究。近 10年来，综合运用各种现代技术，研究了云南西双版纳热带雨林地区、滇南热带常绿阔叶林地区、云南部分河流干热河谷地区及我国西部地区的土壤放线菌资源；开拓了动物、地衣、有毒植物放线菌资源研究的新领域；还研究了中国南海北部湾海洋放线菌资源，建立了含 6万多株放线菌资源的菌种库。现报告部分研究进展。
　　**节放线菌分离方法的重要性
　　要开发利用放线菌资源，从中发现具有利用价值的生物活性物质，发现新资源是重要前提之一。对放线菌资源研究的主要方向有两个：一是特定来源地放线菌的多样性；二是获得尽可能多的有药用价值的未知放线菌资源。为此，分离方法必须从样品来源、预处理、培养基的设计、抑制剂的选择和用量、培养时间等综合配套，以获得尽可能多样的未知放线菌为中心，以实验样品的采集和分离方法为重点。本节叙述如下相关问题。
　　一、实验样品采集
　　围绕探索放线菌的多样性和获得尽可能多的未知放线菌的目的，根据我们 50年的经验，实验样品的采集要掌握 3个原则：一是尽可能从原始环境采集样品，特别是原始森林，其放线菌种类非常丰富；极端环境（极端盐、碱、酸，高温、干旱、沙漠、极地、深海等）的未知菌种类也丰富，但难于培养。二是从未研究过的环境或对象（如动物、有毒植物、地衣等）取样。三是增加样品来源生态环境的多样性，植被（植物种类等）、土壤、小气候、湿度、海拔、坡度、光照、阴坡、阳坡等尽量不同，尽量多点混合。样品应放在无菌容器中，运输过程和长期保存应置于 4℃冰箱中。
　　二、样品的预处理
　　预处理的目的在于分离纯培养放线菌时减少非放线菌（尤其是样品中广泛存在的革兰氏阴性菌和真菌）的干扰，同时又要保护放线菌。可采用以下方法。
　　（1）粪便样品要用无菌竹签铺一薄层于无菌培养皿表面，防止长霉；土样及其他样品用无菌纸分装，均于 25～35℃阴干，可以消除多种细菌干扰。
　　（2）80～120℃干热处理 1h；或将稀释 10倍的样品提取液 55℃水浴 6min；或将样品提取液用超声波（160W，59kHz）处理 40s。减少细菌干扰，增加放线菌出菌率。
　　（3）样品提取液也可以用 1.5%苯酚 30℃处理 10min。
　　三、分离培养基的选择
　　放线菌分离培养基的选择至少要考虑以下几点。
　　**，为了从特殊环境、特殊来源的样品分离到特殊放线菌，培养基的设计要与之相适应，要突出与目的菌有关的因素，如温度、 pH、盐浓度及组成。例如，为了分离嗜盐放线菌，必须在培养基中加 20%以上的各种盐类，还得考虑培养基成分的可溶性、拮抗性等。
　　第二，为了分离特定类群的放线菌，例如，分离游动放线菌，可以在培养基中加入甲壳素类物质，或用花粉“诱捕”。
　　第三，线菌对其产生的抗生素有抗性，所以加入大量抗生素，可以选择性分离耐受这种抗生素的菌种。
　　第四，为了增加放线菌的多样性，尤其是增加稀有放线菌的出菌率，一般应采用多种成分差异较大的培养基，如本室设计的 YIM 7、YIM 212、YIM 91号培养基等。
　　第五，放线菌的生长较慢，通常情况下，要采用所谓的贫营养培养基。
　　四、抑制剂
　　妙用抑制剂是分离放线菌的关键之一。一般可用 50～75mg/L的重铬酸钾，或制霉菌素 100mg/L、放线酮 50mg/L、萘啶酸 25～40mg/L。为了分离特定类群的放线菌，可以在培养基中加入对目的菌有抗性的抑制剂。例如，分离链孢囊放线菌和马杜拉放线菌时，可加入过量的庆大霉素。
　　第二节土壤放线菌资源
　　土壤是放线菌的主要栖息地之一，国际上对土壤放线菌研究的时间最长，成果最丰富。
　　近10年来，本实验室利用各种现代技术，对云南代表性地区及海南岛至新疆（与胡焕庸线的交叉线）不同生态环境的土壤放线菌资源进行了深入研究（图 1-2），探索放线菌资源分布的特点和规律，分离、鉴定、保存了近两万株土壤放线菌及其 DNA。利用各种现代技术对其利用价值进行评估，获得了大批值得开发的菌株。以下重点叙述近10年的部分研究成果。
　　图 1-2 采样地区（彩图请扫封底二维码）
　　一、云南西双版纳热带雨林自然保护区的土壤放线菌资源
　　西双版纳位于云南南部，北纬 21°10′～22°24′和东经 101°10′～101°50′，属横断山脉的南延部分。年平均气温 23.8℃，年平均降雨量 1500mm。西双版纳热带雨林自然保护区，总面积约 24.2万 hm2，是我国生物多样性最为丰富的地区之一。热带雨林的显著特点是多板根，多附生植物，多老茎生花结果植物。典型物种有望天树、篦齿苏铁、云南苏铁、藤枣、四数木、山桂花、红椿、土沉香等非常珍贵的植物及亚洲象、鼷鹿、印度野牛、苏门羚、豹、蜂猴、灰叶猴、绿孔雀、白鹇、犀鸟等珍稀野生动物。采样的望天树保护区、勐养保护区、尚勇保护区属于西双版纳国家级自然保护区的核心区，植被保存完好（图 1-3）。从这 3个热带雨林采集土壤样品 150份，共分离放线菌 1158株，用 16S rDNA序列对比，鉴定到属、种，共获得纯培养放线菌 9目 15科 36属（表 1-1）。其中游动孢囊菌属（ Planosporangium）、球孢囊菌属（ Sphaerisporangium）是非常罕见的放线菌。根据现行共识（与已知种的相似性在 98.8%以下的菌株可能是新种），有多达 36%的菌株是潜在新种，发表新种 6个，可见西双版纳热带雨林蕴藏着大量未知放线菌资源。这个地区放线菌分布的显著特点是多样性很丰富，未知菌很多。
　　图 1-3 西双版纳热带雨林（彩图请扫封底二维码）
　　表 1-1 西双版纳热带雨林土壤放线菌的组成
　　二、怒江大峡谷的土壤放线菌资源
　　怒江大峡谷位于云南西北部怒江傈僳族自治州，是由巍峨高耸的碧罗雪山、高黎贡山、担当力卡山与奔腾的怒江、独龙江相间构成的深切割裂大峡谷。怒江大峡谷，在云南省内自北向南超过 300km，平
　　均深度为 2000m，最深处在贡山丙中洛一带，达 3500m，被称为“东方大峡谷”。高山峡谷和温暖潮湿的
　　亚热带山地气候极利于动植物的生存繁衍。森林覆盖率为 44%，有大量珍稀名贵树种。其中仅中草药就
　　有 356种，兰花多达 140多种，野生动物 474种，如齿蟾、戴帽叶猴、灰腹角雉，只栖息该地。
　　本研究从怒江大峡谷怒江傈僳族自治州段选取 4组样区（即丙中洛、石月亮—贡山、福贡—泸水、泸水）（图 1-4）采集土壤样品，用 9种培养基分离、鉴定放线菌 351株。它们属于 8目 14科 27属（表 1-2），其中 Microterricola、Paenarthrobacter、Terrabacter、Williamsia是罕见的种类。 351株放线菌
　　中有 13株（约占 4%）是潜在新种，潜在新种的比例相对较低。
　　图 1-4 怒江大峡谷取样地区（彩图请扫封底二维码）
　　表 1-2 怒江大峡谷土壤放线菌的组成
　　纯培养和免培养两种方法的研究结果显示，研究的地段至少有 75属的放线菌存在，有36%（27属）获得了纯培养（图 1-5和图 1-6，表 1-3）。还有 11个纯培养得到的属，在高通量（免培养）方法中却没有检测到。为什么约有 10%的放线菌通过纯培养都能获得，免培养法反而检测不到？最可能的原因是目前高通量测定 16S rDNA个别区段的方法分辨率不够。
　　图 1-5 不同样品间在属水平上放线菌的相对丰度（彩图请扫封底二维码）
　　图 1-6 利用维恩图比较免培养（获得 75属）、纯培养方法（27属）研究结果，其中 16属在 2种方法的分析中都有发现
　　表 1-3 用免培养、纯培养方法研究怒江大峡谷地区土壤微生物的对照表