人体组织学与胚胎学实验(高等院校医学实验教学系列教材)

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第一篇组织学与胚胎学基本形态结构
　　第一章绪论（Introduction）
　　一、实验目的与要求
　　1.熟练地使用显微镜，能够观察、辨认和描述机体正常结构以验证和巩固理论知识，达到理论与实践相结合的目的。
　　2.通过对机体细胞、组织和器官三个层次内容的观察与讨论，逐步培养学生对人体基本结构的认识与理解，并培养学生分析问题、解决问题和动手操作的能力。
　　3.了解组织切片的一般制作过程、常用的染色方法和组织细胞的染色特性。
　　4.能够正确地描述和绘制组织或器官的基本形态结构。
　　5.在整个教学过程中，严格按照“三基”（基本理论、基本知识和基本技能）和“三严”（严肃的科学态度、严格的科学作风和严密的科学方法）的要求进行学习活动。
　　6.以现代教育理论为指导，以现代教育技术为平台和手段，以教师为主导，以学生为中心，培养学生独立观察与思考、综合分析与鉴别判断，以及准确描述形态结构的能力。
　　7.通过本课程的学习，了解本学科的近现代发展概况、重要科学成就、主要研究方法和研究进展等，为后续医学相关课程的学习奠定良好的基础。二、实验方式与注意事项
　　（一）实验方式
　　本课程采用“先理论后实验”的教学方法。每个实验教学班 15～ 30名学生，由 1名教师进行实验教学。教学实验室为每位学生配备一台光学显微镜以供独立观察之用，并配备数字交互式微型摄像系统和多媒体投影设备辅助实验教学。实验教学按照大纲，通过导学、观察与思考、翻转课堂与讨论，以及检查与总结等教学环节，一方面加深了学生对组织学理论知识的理解，锻炼了学生对组织或器官标本的组织学形态结构的观察、描述和判断的基本技能，另一方面也培养了学生在自主学习、独立思考、积极动手、勇于表达、小组合作等方面的综合素质。
　　（二）注意事项
　　1.学生应以严谨的科学态度，认真有序地完成各项实验教学内容，严格遵守实验室规则。2.学生须提前10分钟到实验室，不迟到，不早退，不得无故缺席和中途离开实验室。
每次实验要穿戴好整洁的工作服并携带好实验必备用品，如理论教材、实验指导、实验报告纸、铅笔、红蓝彩色铅笔和尺子等。
　　3.显微镜必须经常保持清洁。机械部分可用纱布或绸布擦净；光学部分只能用擦镜纸轻轻擦拭，严禁用手或其他物品擦拭以防污损。
　　4.实验课前必须做好每次实验教学内容的预习。在教师的指导下，严格按照教学要求进行实验，并独立而有序地完成每次实验教学内容。学生有问题举手提出，积极思考并参与问题的讨论。
　　5.认真而仔细地观察每张组织或器官标本。不得擅自移动示教镜、示教镜上的组织切片，以及其他实验器材。
　　6.爱护和正确使用一切实验标本、仪器设备和其他公物，一经损坏立即向老师报告，并做好登记。
　　7.要保持实验室的清洁卫生，不得随便丢弃杂物等。每次实验后，值日同学要认真地做好实验室的卫生清理工作，并经教师检查合格后方可离开。
　　（三）实验教学效果的检测方法
　　1.通过翻转课堂、教师提问、线上线下测试等手段，检验学生对实验相关理论知识的掌握程度。
　　2.通过翻转课堂、分组讨论与结果展示等环节，考查学生分析问题与解决问题、自主学习与小组协作，以及表达展示等方面的能力。
　　3.通过检测学生在镜下以及图片上辨认与判断重点教学目标的正确率，量化实验教学的效果和学生的综合实验技能水平。
　　4.实验课课堂作业评阅采用形成性评价的方式进行，按 A、B、C、D 4个等级进行评价。三、显微镜的使用和注意事项
　　（一）显微镜的使用方法
　　1. 位置一手握持镜臂，另一手托住镜座。放置桌面，距桌沿不得少于 10cm。课间休息离开座位时，应将显微镜移向桌内，以免碰落损坏。
　　2. 对光打开电源，旋转光线旋钮至合适光亮。转动旋转盘，将低倍物镜对正载物台的圆孔，转动粗调节器使载物台距物镜约 5mm。用双眼从目镜观察，调节双筒目镜间距离，直到看到一个均匀明亮的视野。
　　3. 低倍镜的使用取标本擦净，使盖玻片朝上，放在载物台上，用推片器夹紧，并将组织切片推移到载物台圆孔的正中。然后，以双眼从目镜观察，同时转动粗调节器使载物台慢慢下降至物像清晰。必要时，再用细调节器调节焦距。
　　4. 高倍镜的使用先将需高倍镜观察的组织区域于低倍镜下移至视野正中，然后转入高倍镜。再从目镜观察，并转动细调节器至物像清晰。
　　5. 油镜的使用先在高倍镜下将需观察的组织移至视野正中，转离高倍镜。在标本上滴液状石蜡一滴，转换油镜，此时油镜头浸入油滴而不与玻片接触。再从目镜观察，并转动细调节器至物像清晰。使用油镜时，注意光线要明亮。
　　6.本教材中一般低倍指的是 4倍或 10倍，高倍指的是 40倍。
　　（二）显微镜使用的注意事项
　　1.搬动显微镜慎拿轻放，使用显微镜要严格遵守规程。
　　2.观察时应同时睁开两眼。右手书写者，以左眼从目镜观察，以右手操纵粗、细调节器。用右眼和右手配合进行绘图或文字描述。
　　3.显微镜必须经常保持清洁。机械部分可用纱布或绸布擦净；光学部分只能用擦镜纸轻轻擦拭，严禁用手或其他物品擦拭以防污损。
　　4.油镜使用后，应立即用擦镜纸蘸少量专用清洗剂将镜头擦净。随后应对沾油的玻片也进行相应清洁。
　　5.显微镜部件不得拆卸或互相调换，若有故障，应立即报告老师进行处理，不得自行修理。
　　6.显微镜用毕，应将物镜转离载物台中央的圆孔，并上升载物台，将显微镜轻轻放回原处。
　　四、光学显微镜的标本制作
　　在组织研究中最常见的方法是制备可以借助光学显微镜（ light microscope，LM）观察的组织切片。这些标本的制作方法包括石蜡切片法、冷冻切片法、撕片法、涂片法和磨片法等，实验课中使用最多的是石蜡切片法制作的组织切片。最常用、使用最广泛的染色技术是苏木精 –伊红染色法（hematoxylin-eosin staining），简称 HE染色法。苏木精为碱性染料，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸呈紫蓝色。伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的某些成分呈红色。
　　石蜡切片 HE染色法标本制作的基本步骤包括取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、脱蜡、染色和封片等步骤，具体步骤如下：
　　1. 取材和固定根据实验目的取出人或动物的新鲜组织，并将其尽快投入固定液内，一般固定 6～ 24h。固定的目的是使组织内的蛋白质凝固，防止自溶，以保持组织原来的结构成分和形态结构。常用的固定液有多聚甲醛（ paraformaldehyde）、酒精和 Bouin液等。
　　2. 脱水和透明固定液一般为水溶液，如前面采用的是石蜡包埋，应先进行脱水。为减少组织收缩的影响，脱水时应从低浓度乙醇开始，从 60%、70%、80%、90%、 95%，逐步过渡到无水乙醇，以彻底置换出组织中的水分。组织脱水后，再将其投到二甲苯中，以置换出乙醇并利于包埋剂渗入，至组织透明取出。
　　3. 浸蜡与包埋把透明后的组织块放入融化的石蜡中（温度为 56～ 60℃），时间 2～ 3h，使石蜡完全充填于组织间隙内。随后以常温冷却，石蜡凝固，组织块即包埋在石蜡中。
　　4. 切片与贴片包埋好的组织块用切片机切成 5～ 7μm的薄片。在温水中展平，后贴附于载玻片上。
　　5. 染色和封片染色的目的是使组织内不同的结构染上不同的颜色，以利于镜下观察。
　　HE染色法步骤如下：
　　（1）脱蜡：将切片放入二甲苯内约 10min，再入 100%、95%、90%、80%、70%乙醇各 5～ 10min；入水数分钟。
　　（2）染核：入苏木精染液 5～ 10min，用水洗去多余染液，入 0.5%～ 1%盐酸乙醇分化数秒钟，水洗分化约 1min。
　　（3）染胞质：放入伊红染液 2～ 3min，用 70%乙醇进行分色。
　　（4）脱水：经 80%、90%、95%、100%乙醇各脱水一次，每次 5～ 10min。
　　（5）透明：放入二甲苯透明 2次，每次 10～ 15min。
　　（6）封固：在切片组织所在处滴加适量封片剂，后放上盖玻片封闭保存，干燥后便可镜下观察。
　　结果：细胞核呈紫蓝色；细胞质呈粉红色。
　　五、电子显微镜的标本制作
　　在组织学研究中较常见的电子显微镜主要包括透射电镜（ transmission electron microscope，TEM）和扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）两大类。本章节主要介绍透射电镜超薄切片的制作方法。
　　透射电镜的成像是由一定强度的电子束穿透标本而成像。由于电子射线的穿透能力比较低，电镜又需要很高的分辨率和放大率，因此，电镜标本的超薄切片厚度一般要在 0.03～ 0.05μm，以获得高分辨率的超微结构图像。超薄切片制作过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、切片和染色等环节。
　　1. 取材是超薄切片技术的关键环节。由于生物组织离体后，细胞会立即释放出各种水解酶引起细胞自溶，使细胞内部微细结构发生变化。因此，为尽可能避免产生人工假象，取材时有以下要求：
　　（1）取材要快，一般要求在 1min内把组织块浸入固定液。（2）组织块要小，一般切成 0.5～ 1.0mm。
　　（3）所用固定液及容器须预冷，以降低离体细胞内水解酶的活性，尽可能减少细胞自溶。
　　（4）由于电镜观察视野小，具有很大的局限性，所以，选择部位要准确可靠。
　　（5）切割组织的刀和剪必须锋利洁净，避免拉、锯、压等动作造成细胞损伤。
　　2. 固定
　　（1）固定的作用：①破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶；②稳定细胞物质成分，如核酸、核蛋白、糖类和脂类，使之发生交联，减少或避免抽提作用，以保存组织成分；③在一些细胞组分之间以化学反应和物理反应建立交联，以提供一个骨架来稳定各种细胞器的空间构型；④提供一定的电子反差。
　　（2）常用的固定剂
　　1）四氧化锇（osmium tetroxide）：俗称锇酸，为一种强氧化剂，为浅黄色结晶，其分子式 OsO4，熔点 41℃，沸点 131℃，在水中的溶解度为 7.24%（25℃）。其水溶液为中性，有毒性。
　　2）戊二醛（glutaraldehyde）：分子式为 C5H8O2。市售的戊二醛通常是 25%或 50%的水溶液，其 pH为 4.0～ 5.0，并保存在低温处，且不宜存放时间过长。
　　3）高锰酸钾：一种强的氧化剂，对磷脂蛋白类有特别良好的固定作用。可用于保护细胞的膜相结构，如细胞膜、内质网等。尤其是对神经髓质效果更为显著，但对于胞内的颗粒性或纤维状结构几乎不能固定。常用于植物叶绿体结构及神经纤维结构的研究。
　　（3）固定方法：目前，用于生物样品超薄切片技术的主要固定方法是化学固定法。采用戊二醛（或戊二醛 +多聚甲醛）固定 l～ 3h后，经相应的缓冲液冲洗，再用 1%锇酸后固定 1～ 2h。
　　（4）固定时注意事项
　　1）固定液浓度要适宜，一般戊二醛常用浓度为 1%～ 4%，锇酸为 1%～ 2%。
　　2）固定液的渗透压须调节到接近组织、细胞的生理值。固定液的渗透压是通过改变缓冲液的浓度或者通过增加钠、钙和镁等电解质或葡萄糖和蔗糖等非电解质来调节的。
　　3）固定液的 pH：须接近所要固定组织的 pH。由于大部分动物组织的平均 pH约7.4，因此，电镜固定液的 pH都在 7.2～ 7.4之间。
　　4）固定时的温度：理论上，低温能降低酶的活性，减少细胞自溶和胞内物质的抽提，因此大部分样品宜在 0～ 4℃