发酵工程（第2版科学出版社十三五普通高等教育本科规划教材）

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**章　发酵工程概述
　　发酵工程是生物工程的重要组成部分和基础，是生物工程产业化的重要环节。发酵工程既为人类创造物质财富，又在生产实践中不断地得到丰富和发展。可以预见，随着科学技术的进步，发酵工程必将得到迅速的发展，从而影响工、农、医等众多领域，为人类的发展带来巨大的推动作用。
　　发酵工程的内容随着科学技术的发展而不断扩展和充实。现代的发酵工程不仅包括菌体生产和代谢产物的发酵生产，还包括微生物机能的利用。其主要内容包括生产菌种的选育，发酵条件的优化与控制，反应器的设计及产物的分离、提取与精制等。
　　**节　发酵工程的概念
　　一、发酵的定义
　　（一）发酵的传统概念
　　发酵（fermentation）最初来自拉丁语“发泡”（fervere）这个词，其最早用来形容酵母作用于果汁或发芽谷物等含糖物质并产生CO2等气体的现象。
　　（二）生理生化意义的发酵
　　巴斯德研究酒精发酵后认为，发酵是酵母在无氧条件下的呼吸过程，是“生物获得能量的一种形式”。后续一系列相关研究成果对该定义进行了拓展和修订，形成了目前发酵的生理生化概念：发酵是一种生物氧化方式，其特征是有机物氧化放出的电子直接交给基质本身未完全氧化的中间产物，同时释放出能量和产生各种代谢产物。
　　（三）发酵的现代概念
　　在工业领域，把一切依靠微生物的生命活动而实现的工业生产均称为发酵。这样定义的发酵就是“工业发酵”。工业发酵要依靠微生物的生命活动，生命活动依靠生物氧化提供的代谢能来支撑，因此工业发酵应该覆盖微生物生理学中生物氧化的所有方式：有氧呼吸、无氧呼吸和发酵。
　　二、发酵工程的定义
　　发酵工程是利用微生物特定的性状和功能，通过现代化工程技术，生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系；是将传统发酵与现代的DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的工艺方法；也可以说是渗透有工程学的微生物学，是发酵技术工程化的发展。由于主要是利用微生物发酵过程来生产产品，因此发酵工程也可称为微生物工程。
　　三、发酵工程的特点
　　发酵工程的主要材料是微生物，是微生物参与的，由其生长繁殖和代谢反应所引起的生物反应过程。这些过程既有利用原有微生物特性获得某种产物的过程，又有利用微生物消除某些物质（废水、废物的处理）的过程，但是它们都是活的微生物的反应过程。这一过程中的产物可以是过程的中间或终点时的代谢产物，也可以是有机物质的降解物或微生物自身的细胞。
　　发酵工程的主要技术手段和设备与化学工程非常接近，化学工程中的许多单元操作在发酵工程中得到应用。国外许多学术机构把发酵工程作为化学工程的一个分支，称为“生化工程”。但由于发酵工程是培养和处理活的有机体，因此除了与化学工程有共性外还有它的特殊性。例如，空气除菌系统、培养基灭菌系统等都是发酵工程工业中所特有的。再如化学工程中，气液两相混合、吸收的设备仅有通风和搅拌的作用，而通风机械搅拌发酵罐除了上述作用外，还包括复杂的氧化、还原、转化、水解、生物合成及细胞的生长和分裂等作用，而且还有其严格的无菌要求，不能简单地与气体吸收设备完全等同起来。提取部分的单元操作虽然与化工中的单元操作无明显区别，但为适应菌体与微生物产物的特点，还要采取一些特殊措施并选用合适的设备。简言之，发酵工程就是化学工程中各有关单元操作结合了微生物特性的一门学科。
　　与化学工程生产技术相比，发酵工程的微生物反应过程具有以下特点：①作为生物化学反应，通常在温和的条件下进行（如常温和常压），因此设备不需要考虑防爆等问题；②原料来源广泛，通常以糖、淀粉等碳水化合物为主，只要不含有毒物质，一般无精制的必要；③反应以生命体的自动调节方式进行，因此数十个反应过程能够像单一反应一样，在单一反应器内进行；④既能生产多种小分子产品，也能很容易地生产复杂的高分子化合物，如各类酶等；⑤由于生命体特有的反应机制，能高度选择性地进行复杂化合物在特定部位的氧化、还原、官能团导入等反应；⑥生产发酵产物的生物物质菌体本身也是发酵产物，富含维生素、蛋白质、酶等有用物质，除特殊情况外，发酵液等一般对生物体无害；⑦通过微生物的菌种改良，能够利用原有生产设备大幅度提高生产水平。发酵过程的这些特征决定了发酵工程的种种优点，使得发酵工程成为生物工程的核心之一而受到了广泛重视。
　　但因为发酵工程所依赖的微生物反应过程存在着其特有的规律，所以发酵过程中也有一些问题应该引起特别的注意：①底物不可能完全转化成目的产物，副产物的产生不可避免，因而造成了提取和精制困难，这是目前发酵行业下游操作落后的原因之一；②微生物的反应是活细胞的反应，产物的获得除受环境因素影响外，也受细胞内因素的影响，并且菌体易发生变异，实际控制相当困难；③原料是农副产品，虽然价廉，但质量和价格波动较大；④生产前准备工作量大、花费高，相对化学反应而言，反应器效率低；⑤因为过高的底物或产物浓度不利于细胞生长和产物合成，为提高产量常需采用大体积的反应器；⑥发酵废液常具有较高的化学需氧量（chemical oxygen demand，COD）和生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD），如不进行处理会造成环境污染；⑦发酵生产在操作上最需要注意防止杂菌污染，全过程一般要求在无菌状态下运转，一旦失败，就要遭受重大损失。
　　四、发酵工程常见的主要发酵类型
　　微生物发酵是一个错综复杂的过程，尤其是大规模工业发酵，要达到预定目标，更是需要研发和使用多种多样的发酵技术。目前常用的发酵技术，可按其某些特征人为地分为以下几类（图1-1）。
　　（一）厌氧发酵与好氧发酵
　　厌氧发酵是利用一些专性或兼性厌氧微生物进行的发酵，如丙酮、丁醇、乳酸、乙醇的生产。因其不需供氧，整个发酵过程不需要通入空气，是在密闭的条件下进行的。厌氧发酵的设备一般比较简单。严格的厌氧液体深层发酵的主要特色是排除发酵罐中的氧。罐内的发酵液应尽量装满，以便减少上层气相的影响，有时还需要充入无氧气体。发酵罐的排气口要安装水封装置，培养基应预先处理以减少其中的含氧量。此外，厌氧发酵需要使用大剂量接种（一般接种量为总操作体积的10%～20%），使菌体迅速生长，减少其对外部氧渗入的敏感性。乙醇、丙酮、丁醇和乳酸等都是采用液体厌氧发酵工艺生产的。在农村普遍推广的沼气发酵也是典型的厌氧发酵（图1-2）。
　　好氧发酵是利用需氧的微生物进行的发酵。其特点是在发酵过程中需要不断地供给微生物氧气（或空气），以满足微生物呼吸代谢。多数发酵生产属于有氧发酵。好氧发酵的方法有通气、通气搅拌或表层培养等类型。
　　（二）液态发酵与固态发酵
　　液态发酵（液体培养），是指将微生物接种到液体培养基中进行培养和发酵的过程。进行液体培养时，氧气的需求和供给是必须考虑的重要环境因素。由于在现代发酵工程中大多数发酵微生物是好氧性的，而在液体培养条件下微生物只能利用其中的溶解氧，因此如何保证在培养液中有较高的溶解氧浓度至关重要。在实验室中进行的好氧菌液态发酵方式主要有四种：试管液体培养、浅层液体培养、摇瓶培养和台式发酵罐培养。工业生产中常见的好氧菌液态发酵方式是通气培养，该方法适于抗生素、氨基酸、核苷酸等的发酵。具体的培养方式包括浅盘培养和发酵罐深层培养。其中，液体深层培养是在青霉素等抗生素发酵中发展起来的技术，由于其生产效率较高、易于控制、产品质量稳定，因此在发酵工业中被广泛应用。也有部分发酵产品的生产不需要氧气，过多的氧气甚至会影响菌体生长，这就必须给发酵体系制造无氧环境。实验室中，用液体培养基进行厌氧菌培养时，一般采用添加有机还原剂（如巯基乙醇、半胱氨酸）或无机还原剂（铁丝等）的深层液体培养基，其上方封以凡士林-石蜡层，如放在厌氧罐中培养，则效果更好。工业生产中常见的厌氧液态发酵方式是静置培养，该方法可用于乙醇、丙酮-丁醇、乳酸等的发酵。
　　固态发酵（固体培养或固体发酵），是指利用固体培养基进行培养和发酵的过程。微生物贴附在营养基质表面生长，所以又可称为表面培养。固体培养在微生物鉴定、计数、纯化和保藏等方面发挥着重要作用。一些丝状真菌可以进行生产规模的固态发酵。实验室常见的固体培养方法主要有试管斜面、培养皿平板、较大型的克氏扁瓶和茄子瓶斜面等，用于菌种的分离、纯化、保藏和生产种子的制备。生产中好氧真菌的固体培养方法都是将接种后的固体基质薄薄地摊铺在容器的表面，这样，既可使菌体获得充足的氧气，又可以将生长过程中产生的热量及时释放，这是传统的曲法培养的基本原理。进行固体培养的设备有较浅的曲盘、转鼓和通风曲槽等。生产实践中对厌氧菌固体培养的例子不多见。在我国传统的白酒生产中，一般采用大型深层地窖进行堆积式的固态发酵。虽然其中的酵母菌为兼性厌氧菌，但也可以算作厌氧固体酵的例子。总之，固体培养的设备简单，生产成本低，但是pH、溶解氧和温度等不易控制，耗费劳动力多，占地面积大，容易污染，生产规模难以扩大。生产上的固态发酵实例见表1-1。
　　表1-1　固态发酵实例
　　（三）分批发酵与连续发酵
　　分批发酵又称为分批培养，是指将所有的物料（除空气、消泡剂、调节pH的酸碱物外）一次加入发酵罐，然后灭菌、接种、培养，最后将整个罐的内容物放出，进行产物回收，清理罐体，重新开始新的装料发酵的发酵方式。在整个培养过程中，除氧气的供给、发酵尾气的排出、消泡剂的添加和控制pH加入酸或碱外，整个培养系统与外界没有其他物质的交换。分批发酵过程中随着培养基中的营养物质的不断减少，微生物生长的环境条件也随之不断变化。因此，分批发酵是一种非稳态的培养方法（图1-3）。分批培养系统属于封闭系统，只能在一段有限的时间内维持微生物的增殖，微生物处在限制性的条件下生长，表现出典型的生长周期（图1-4）。该方法操作简单、易于掌握，迄今为止，仍是常用的发酵方法，广泛用于多种发酵过程。
　　连续发酵又称为连续培养，是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物培养方式（图1-5）。它与封闭系统中的分批发酵培养方式相反，是在开放的系统中进行的。由于培养基能不断更新，解除了营养基质和环境对微生物生长的限制，因此该方法可以达到稳定、高速培养微生物细胞或生产大量代谢产物的目的。此外，对于细胞的生理或代谢规律的研究，连续发酵是一种重要的手段。相较于分批发酵，连续发酵的主要优势是简化了菌种的扩大培养、发酵罐的多次灭菌、清洗、出料等工序，缩短了发酵周期，提高了设备利用率和生产效率，降低了人力、物力的消耗，使产品更具有商业竞争力。
　　但是连续发酵也存在着现阶段难以克服的缺点。对大部分微生物来说，通过连续发酵研究其生理、生化和遗传特性是很困难的，而用连续发酵进行大规模生产也很难实现。其主要原因是：①连续发酵运转时间长，菌种多退化，容易污染，培养基的利用率一般低于分批发酵；②工艺中的变量较分批发酵复杂，较难控制和扩大；③在次级代谢产物，如抗生素大规模工业化生产中，难以利用连续发酵，因为生成次级代谢产物所需的最佳条件，往往与其菌种生长所需的最佳条件不一致，有的还与微生物细胞分化有关。
　　目前连续发酵主要被用来大规模生产乙醇、丙酮、丁醇、乳酸、黄原胶（图1-6）、食用酵母、饲料酵母以及单细胞蛋白，还可用于石油脱蜡及污水处理并取得了好的效果。例如，丙酮-丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）采用两罐（级）连续发酵生产丙酮-丁醇。**罐培养液的稀释率为0.125h－1，即流速控制成8h更换一次罐内的培养液，发酵温度为37℃，pH 3.4。控制此罐主要发酵菌体，第二罐稀释率为0.04h－1，即25h更换罐内培养液一次，33℃，pH 4.3发酵。这样连续发酵大规模生产丙酮-丁醇溶剂，连续运转一年多，比采用分批发酵方式产生的效