细胞生物学实验指导

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第一部分 基本实验仪器简介及使用方法
实验一普通光学显微镜及使用方法
【实验目的】
1. 掌握普通光学显微镜的结构和成像原理。
2. 掌握普通光学显微镜的使用方法。
【实验原理与方法】
　　细胞的发现和光学显微镜的发明分不开。光学显微镜简称显微镜或光镜，是利用光线照明微小物体形成放大影像的仪器。显微镜的发明和使用已有400多年的历史。1590年前后，荷兰的汉斯（Hans）父子创制了放大10倍的原始显微镜。1665年，英国物理学家胡克（R. Hooke，1635—1703）创造了第一架具有科学研究价值的显微镜，并首次观察了木栓的纤维图像，发现了细胞。真正观察到活细胞的是荷兰科学家列文虎克（Antonie van Leeuwenhoek，1622—1723），他利用自制的显微镜首次观察到了活细胞。
一、普通光学显微镜的成像原理
　　普通光学显微镜从结构上可分光学、照明、机械3个部分。作为显微镜核心部分的光学部分包括目镜、物镜和聚光器。
　　光学显微镜的物镜和目镜的结构虽然比较复杂，但它们的作用都相当于一个凸透镜。因此，光学显微镜的成像也是基于凸透镜的成像原理。在成像时，聚光器将光线汇聚到被检标本，标本位于物镜一侧1～2倍焦距之间，故物镜可使标本在物镜的另一侧形成一个倒立的放大实像，该实像又位于目镜1倍焦距之内，目镜可使其在目镜同侧形成一个正立的放大虚像。经过物镜和目镜的两次成像，就可以观察到一个倒立的放大虚像（图1-1）。
二、普通光学显微镜的基本结构
　　普通光学显微镜（图1-2）的基本结构包括机械、照明和光学3个部分。
　　机械部分主要由镜座、镜臂、粗准焦螺旋、细准焦螺旋、载物台、标本夹、标本推进器、物镜转换器、目镜镜筒等组成。机械部分的主要功能包括支撑显微镜、固定标本装片等。
　　照明部分由光源、亮度调节旋钮组成，现代显微镜一般都采用电光源照明，通过亮度调节旋钮控制亮度。
　　光学部分由目镜、物镜和聚光器组成。
　　在显微镜的结构中，几个常用术语含意如下。
　　明视距离：从眼睛的晶状体到放大的虚像的距离，为250mm。
　　机械筒长：镜筒管上缘到物镜螺旋肩基部的长度，以mm表示，一般为160mm。
　　光学筒长：由物镜的上焦平面到目镜的下焦平面之间的距离。其长度随机械筒长及物镜而不同，光学筒长略小于机械筒长。
三、普通光学显微镜的光学部分
1. 显微镜的基本光学参数
　　1）分辨力　　分辨力（resolving power）也叫分辨本领或解像力，是光镜最重要的性能指标，定义为在250mm的明视距离处，能分辨清楚尽可能近的两点的能力，即分辨出标本上相互接近的亮点间的最小距离的能力。据测定，人眼的分辨力约为0.2mm，而显微镜的分辨力可达0.2μm。显微镜的分辨力由物镜的分辨力决定，物镜的分辨力就是显微镜的分辨力，而目镜与显微镜的分辨力无关，它只是将物镜已分辨的影像进行第二次放大。显微镜的分辨力（R）可用下式计算：
R＝0.61λ/N. A.
式中，λ为照明光源的波长；N. A. 为物镜的数值孔径（numerical aperture，N. A），也称镜口率，由两个参数组成，即N. A. ＝n sin（α/2）。N. A. 等于物镜和被检标本之间介质的折射率（n）与　　物镜所接受光锥的顶角（α，即镜口角）一半的正弦值的乘积。物镜与标本之间介质的折射率，空气为1，水为1.33，油为1.5左右。
　　sin（α/2）的最大值为1，n的最大值为1.5。将这些数值代入公式，得到光学显微镜的最大分辨力R＝0.61×0.5μm/1.5＝0.2μm，即光学显微镜的最大分辨力约等于可见光最短波长的一半。细胞内的结构如线粒体、叶绿体、中心体、核仁等在这种分辨力水平观察到的结构，称为显微结构。
2）放大率　　放大率（magnification）也称放大倍数，是光镜性能的另一重要参数，是眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值，放大倍数是指长度而不是指面积或体积。一台显微镜的总放大倍数等于　　目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。
　　目镜放大倍数MF目＝250mm/f’目
　　物镜放大倍数MF物＝160mm/f’物
式中，250mm为明视距离；160mm为光学筒长；f’目为目镜焦距；f’物为物镜焦距。
　　显微镜的总放大倍数MF总＝250/f’目×160/f’物
　　目镜的焦距不能太短，因为人眼瞳孔要与出射光瞳重合，一般在10mm以上，放大率不高，即250/10＝25，光学筒长也不能无限延长，只有靠减小f’物来提高放大率。
3）焦点深度　　
　　在视野中垂直范围内能观察到的界限为焦点深度（depth of focus），也就是调焦看清楚标本的某一物点时，不仅这一点能看清楚，此点上下两侧也能看清楚，能看清楚的厚度叫焦点深度，焦点深度d可用下式表示：
d＝kn/M N. A.
式中，k为常数，约0.24mm；M为总放大倍数；n为介质折射率。d与M和N. A. 成反比，即放大倍数越高，数值孔径越大，而焦点深度越浅。
4）工作距离　　
　　工作距离（working distance，W. D）是从物镜的第一个镜片表面到盖玻片表面或标本表面的距离。数值孔径越大，工作距离越小，一般干燥系物镜的N. A. 为0.4时，工作距离为0.5mm，而N. A. 为1.4时，工作距离只有0.1mm。
5）亮度和清晰度　　
　　亮度是指像的光亮程度，这与显微镜照相和投影关系极大。像的亮度与数值孔径的平方成正比，与显微镜总放大倍数的平方成反比。在自然条件下，放大倍数越高，镜像亮度越暗。现代研究用显微镜，一般多采用钨灯光源，调节电压，与自然光相比光线均匀、亮度稳定，提高入射光强度可解决高倍观察时的亮度问题。
　　清晰度是指显微镜形成的物像明显程度的能力。清晰度除仪器性能外，主要受盖玻片的质量和厚度影响，一定要根据物镜上的要求，正确使用盖玻片。
2. 光学透镜的像差
　　像差（aberration）是指白色光线通过透镜后得到一个白色的清晰像点，是影响显微镜性能的主要问题。像差有以下6种。
　　1）色差（chromatic aberration）　　由于白色光线通过透镜后，分数成各种波长的光，因焦距不同，各自形成像点，在不同像平面观察都有颜色，使像变得模糊不清。
　　2）球面像差（spherical aberration）　　由于玻璃透镜表面呈球状，边缘与中间厚薄不一，单色光通过时边缘与中间焦点不同，不能聚焦在同一平面上，得不到理想的像点。
　　3）像散（astigmatism）　　光线通过透镜后，使一点的像变成分离的，互相垂直的短线综合而成的物像使一点变成椭圆形。
　　4）彗形像差（coma）　　物像通过透镜后不再交于一点而形成彗星拖尾形状。
　　5）像场弯曲（curvature of field）　　像场弯曲简称场曲，光线通过透镜后虽然交于一点，但与理想的像点不重合，形成的物像不是一个平面，而是一个回转扭曲面。
　　6）畸变（distortion）　　由于透镜对物体不同部位放大率不同而引起的物像各部分相对比例和实际不一致的变形现象，可使一四面平坦的方形物体变成四边凸出或四边内凹的图像。
　　制作高质量的目镜、物镜、聚光器时，需采用组合透镜的方式来消除上述像差，才能得到清晰度较高的图像。
3. 物镜
　　物镜（objective）是由许多片不同球面半径的凸透镜和凹透镜按严格的尺寸组合起来的。显微镜的质量高低主要取决于物镜。物镜种类繁多，性能相差悬殊，同类物镜因工艺水平的高低，性能迥异。
　　根据色差的校正程度，物镜可分为下列数种。
　　1）消色差物镜　　消色差物镜（achromatic objective）是最常见的物镜，制造容易，金属外壳上不刻代表标志。该物镜校正了轴上点的色差和球面像差，使近轴点消除了彗形像差。但此物镜不能消除球面像差和二级光谱，而且像场弯曲很大，主要是由于光的波长不一，透镜的薄厚不一而导致偏差。因此，消色差物镜不适用做显微摄影。其最佳清晰范围在510～630nm。
　　2）复消色差物镜　　复消色差物镜（apochromatic objective）是用特殊的光学玻璃制成，纠正了可见光的红、绿、蓝3种色光的色差，使之聚焦于一点，质量优良。最佳清晰范围是400～720nm，容纳了全部可见光谱。残留有像场弯曲，使平面物体形成类似球形弯曲面的像，结果使视野中心和边缘的像不能同时准焦。复消色差物镜的金属外壳刻有“APO”字样，供作识别。
　　3）萤石物镜　　萤石物镜（fluorite objective）构成物镜的光学透镜，全部或大部分由萤石透镜取代，故名萤石物镜。色差校正介于消色差物镜与复消色差物镜之间，故又称半复消色差物镜（semi-apochromatic objective）。最佳清晰范围在波长430～680nm的光谱区，包括了绝大部分的可见光谱。物镜的金属外壳刻有“FL”字样。
上述3种物镜都残留程度不同的像场弯曲，使得视场内有不同部分的影像，不能同时准焦。镜检时，尽管可采用分区聚焦、渐次观察的方法，但显微摄影无法把分散于全视场的样品清晰地摄入一帧面幅之中。
　　4）平场物镜　　在研究用显微镜中为了显微摄影必须校正像场弯曲的物镜称为平场物镜（plan objective）。平场物镜有多种类别，外壳上刻有不同的字，以示区别：“PL”（平场物镜）、“PL FL”（平场萤石物镜）、“PLAN”（平场消色差物镜）和“PL APO”（平场复消色差物镜）等，其中以“PL APO”效果最佳。
　　按照前透镜与被检标本盖玻片之间的介质情况，物镜可分下列两类。
　　1）干燥系（dry system）物镜　　镜检时，物镜与盖玻片之间不添加任何液体。例如，4×、10×、20×、40×物镜都属干燥系，使用时不加任何浸没液，只以空气为介质，其折射率为1，所以干燥系物镜的数值孔径小，分辨力也低。
　　2）浸没系（immersion system）物镜　　物镜在使用时，前透镜与盖玻片之间浸满液体。依充填浸液的不同，主要可分为油浸系（oil immersion）和水浸系（water immersion）等类别。最常用的浸没液为香柏油（cedar oil），其折射率为1.515，与盖玻片的折射率相近，且不易干涸。使用水浸物镜时加水，其折射率为1.33。
　　在物镜的金属外壳上，刻有多种符号和数字分别代表物镜性能、规格、类别和使用条件等。
　　物镜的种类：APO（复消色差物镜）、FL（萤石物镜）、PL（平场消色差物镜）、PL FL（平场萤石物镜）和PL APO（平场复消色差物镜）。
　　放大倍数：用数字表示，如4×、10×、20×、40×、100×等。
　　数值孔径：其值多用数字表示，常和放大倍数写在一起，如10×/0.25、40×/0.65、100×/1.3、100×/1.4，数值孔径越大，物镜的性能越好。
　　标准机械筒长：显微镜的机械筒长，主要有两种标准，即160mm和170mm，用数字刻在物镜外壳上，如160、170。∞表示机械筒长为无限大，为某些特种显微镜的筒长。
　　需用盖片的情况：根据物镜的种类不同，镜检时在被检标本（或样品）上加或不加盖玻片。凡需加用盖玻片的物镜，在外壳上刻有需用盖玻片的厚度（mm），该值常与机械筒长写在一起，如160/0.17。
　　常用参数含义如下。