生物化学实验技术（双语版,第2版）

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第一章 生物化学常规技术训练
　　实验1 蛋白质的沉淀和分离——离心技术
　　【实验目的】
　　1.掌握离心分离的原理及操作程序。
　　2.熟悉普通离心机的安装调试、安全使用和日常保全。
　　3.了解普通离心机主机的基本构件和工作原理。
　　【实验原理】
　　蛋白质溶液加入有机溶剂如乙醇，则蛋白质会沉淀析出，因为有机溶剂可使蛋白质胶体颗粒脱去水化膜。溶液中若加入少量中性盐如Na2SO4，则沉淀更加迅速。
　　【器材与试剂】
　　1.器材
　　（1）低速离心机。
　　（2）离心管、药匙、刻度移液管。
　　2.试剂
　　（1）蛋白质溶液：称取牛血清白蛋白0.5g，溶于100mL蒸馏水，配成5mg/mL的蛋白质溶液。
　　（2）95%乙醇。
　　（3）Na2SO4粉末。
　　【实验操作】
　　1.取一支离心管，加入1mL蛋白质溶液，再加入少量 Na2SO4粉末，摇动使溶解。
　　2. 向离心管缓慢加入2mL95%乙醇，剧烈振荡，观察有无沉淀析出，之后4000r/min离心5min，使蛋白质迅速沉淀并收集沉淀蛋白质。
　　【思考题】
　　1.影响离心效率的因素有哪些?
　　2.普通离心机的主要应用范围有哪些?
　　离心技术训练
　　一、离心机的基本原理
　　1. 离心力及其作用 离心技术是分离核酸和蛋白质等生物大分子最常用的方法之一。当悬浮液绕轴旋转时，悬浮中的微粒就同时受到离心力和介质浮力的双向作用，微粒的运动轨迹取决于所受合力的方向。根据物理学原理推导可知：式中，F合表示微粒所受合力；F离表示微粒所受离心力；F介表示微粒所受的介质浮力；V表示微粒的体积；N表示每分钟的转数；r表示微粒至转轴的距离；分别表示微粒与其介质的密度。显然，当时，F合=0，微粒受力平衡，故将维持距转轴恒定的距离转动，也就不可能被分离开；当 时，F合＜0，微粒主要受向心力作用，故而将向转轴方向移动，直至浮到介质表面；当 时，F合＞0，微粒主要受离心力作用而向远离转轴方向移动，直至沉淀到容器底部。因此，是微粒从悬浮液中进行离心分离的基本条件。使用普通离心机的根本目的就在于使这样的微粒从悬浮液中分离出来。
　　从理论上讲，凡是能通过离心分离的微粒在悬浮液静置时，受重力与浮力的共同作用也能自动沉降而得以分离，只是分离所需时间较长，效果较差，沉降本领较弱。一般常用相对离心力（RCF）的大小来表示离心分离的本领强弱。式中，F合表示悬浮微粒在离心分离时所受的合力；F'合表示悬浮微粒在静置分离时所受的合力；g表示重力加速度。
　　只要调节N或/和r就可影响RCF的值，从而改变其离心分离本领。
　　2.离心力与作用时间的积累效应　微粒在悬浮液中被分离的速度快慢除与转动的转数大小有关外，还与离心时间长短有关，即离心力作用于微粒上具有时间积累效应。
　　由此可见，对同一悬浮液可以在较低转速、较长时间得到与较高转速、较短时间相同的分离效果。但是，若转速相差太大，则会受扩散作用影响而使较低转速离心的分离效果下降。
　　二、离心机的组成
　　根据具体的实验要求选择水平式离心机或斜角式离心机。普通离心机分水平式和斜角式两种。实验室常用的离心机主要由离心机盖、离心腔及套筒、显示表盘及调节按钮、电源和平衡附件等部分组成。其中，以下三个部分涉及安全问题，需要特别注意。
　　1. 离心套筒 检查离心套筒内是否有橡皮缓冲胶垫，胶垫上若附着碎玻璃等杂物应清除。
　　2. 电源 电源应选择与离心机使用说明书相吻合的电源，电源插座必须有地线以保证离心安全。若实验室没有合适的电源，则应重新安装电源线，电源插座应靠近离心机以方便操作。
　　3. 平衡附件
　　（1）天平：普通离心机离心以前，需将转子上的负载平衡。
　　（2）烧杯与滴管：烧瓶用来盛配平液，滴管用来吸配平液进行配平。
　　三、离心操作
　　离心之前应检查离心机安放是否平稳，转轴是否牢固，润滑是否良好，套筒内有无异物，离心机盖能否锁紧等。完成以上准备工作后，应先让离心机进行空载运转，观察空载运转情况是否正常，在无异常时方可进行离心。
　　（1）调平称量天平。将置于离心机对称位置上的离心套筒、离心管及内盛物配平，相差不超过0.1g。
　　（2）将平衡好的离心套筒放于离心机对称位置。
　　（3）检查离心机是否安放平稳。
　　（4）关上离心机盖，锁牢。
　　（5）插上电源插头，打开离心机开关。
　　（6）调节离心转速和时间。
　　（7）离心完毕，关离心机，拔下电源插头，任离心机自停。
　　（8）待离心机完全停止转动后，打开机盖，取出离心管。
　　（9）清洁离心套筒、离心管及离心腔，关盖。
　　四、注意事项
　　（1）离心前必须将放置于对称位置上的离心套筒、离心管及离心液进行精确平衡，重量差不超过0.1g。对于高速和超速离心机，不仅要求重量平衡，而且要求配平液的密度与离心液的密度相等，以达到力矩平衡。
　　（2）离心机安放要求水平、稳固，转轴润滑良好。
　　（3）离心管盛液不宜超过3/4。
　　（4）离心机盖应盖紧、锁牢。离心完毕应关离心机、拔掉电源插头任机自停，严禁用手助停，以免伤人损机，使沉淀泛起。
　　（5）注意离心机的保养。离心机使用完毕，擦净离心腔、套筒及机座。经常做好离心机的防潮、防过冷、防过热、防腐蚀药品污染。
　　（6）离心过程若发现异常情况应立即拔下电源插头，然后再进行检查。如听到碎玻璃渣声响，可能是试管被打碎，应重新更换试管。
　　（唐珍 陈建业）
　　Chapter I Routine Technical Training in Biochemistry
　　Experiment 1 Precipitation and Separation of Proteins —Operation of Centrifugation
　　【Purposes】
　　1.To master the basic principle and operational procedures of centrifugal separation.
　　2.To understand the installation and debugging， safe use and daily preservation of the ordinary centrifuge.
　　3.To know the basic components and working principle of the ordinary centrifuge.
　　【Principles】
　　Proteins do not dissolve in some organic solvents， so proteins can be precipitated if the organic solvent (such as alcohol) reaches a certain concentration. Organic solvents decrease protein stability by the dehydration of protein colloidal particles in water solution. Precipitation will be quicker and more complete when a small amount of neutral salts (such as Na2SO4) is also added to the solution.
　　【Apparatus and Reagents】
　　1.Apparatus
　　(1) Low-speed centrifuge.
　　(2) Centrifugal tube， medicine spoon and measuring pipet.
　　2.Reagents
　　(1) Protein solution: Dissolve 0.5g standard bovine serum albumin (BSA) in 100mL dH2O to get a 5mg/mL protein solution.
　　(2) 95% ethanol.
　　(3) Na2SO4 powder.
　　【Procedures】
　　(1)Add 1mL protein solution in a centrifugal tube， then add a small amount of Na2SO4 powder and shake it to dissolve.
　　(2)Then add 2mL 95% ethanol slowly， shake it violently， and observe whether there is precipitate formed. Centrifugate the solution at 4，000r/min for 5min and collect the precipitate.
　　【Questions】
　　1.List the factors that affect centrifugation efficiency.
　　2.What are the main applications of ordinary centrifuges?
　　Introduction of Centrifugation
　　Ⅰ.Principles of the centrifuge
　　1.Centrifugal force and its function Centrifugation is one of the preferred methods for separating various biomacromolecules， such as nucleic acids and proteins. When the suspension rotates around the centrifuge axis， the suspended particles will be affected by the centrifugal force and medium buoyancy at the same time. The movement trajectory of the suspended particles depends on the direction of the resultant force. According to the principle of physics， it leads to the following physical formula:
where FR represents the resultant force; FC represents the centrifugal force; FM represents the medium buoyancy; V represents the particle volume; N represents the rotation number per minute; r represents the distance from the particles to the axis; . and . represent the particle