病原微生物保藏鉴定技术（精）/生物安全与生物资源能力体系建设丛书

作者简介

刘剑君，研究员，现为中国疾病预防控制中心副主任，兼任卫生部结核病专家咨询委员会委员，中国防痨协会理事长，中华医学会结核病学分会常务理事。主持多项科技部研究和国际合作项目；有关循证医学和疾病控制策略的文章在国内外杂志发表，其中“Analysis on factors affecting the epidemic situation of tuberculosis in China”于2005年4月发表在《The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease》，“Progress of DOTS in global tuberculosis control”于2006年3月发表在《Lancet》。

内容简介

第1章 禽流感病毒 1.1?简介 禽流感病毒（Avian influenza virus）属于甲型 流感病毒，按照致病性的不同分成高致病性、低致病性 和非致病性禽流感病毒3类，目前H5N1、H5N6、H5N8、 H7N2、H7N3、H7N7、H9N2、H7N9、H6N1、H10N7、 H10N8、H3N8亚型能够直接感染人类。禽流感病毒的形 态呈球形或者丝状，直径为80～ 120 nm，自外而内分为3个部分，依次是包膜、基 质蛋白和核心。基因组由8个节段组成。禽流感病毒不 耐热，56℃、30 min能使病毒灭活。高致病性禽流感病 毒主要经呼吸道传播，通过密切接触感染的禽类及其分 泌物、排泄物，受病毒污染的水等，以及直接接触病毒 毒株被感染。 1.2?病毒分离培养 H7N9亚型和H10N8亚型禽流感病毒、高致病性禽流 感病毒H5N1、H5N6、H7N7、H7N4等要求在生物安全三 级实验室（biosafety level laboratory-3，BSL-3） 进行病毒分离。低致病性H9N2亚型病毒在生物安全二级 实验室（biosafety level laboratory-2，BSL-2）进 行病毒分离。病毒分离必须遵守生物安全实验室的有关 规定，并严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。 1.2.1?器材与试剂 1.器材 生物安全柜、4℃冰箱、37℃鸡胚培养箱、-80℃超 低温冰箱。 2.耗材 9～11日龄无特定病原体鸡胚、照卵灯、75%乙醇、 一次性注射器、开孔器、无菌镊子、15 mL无菌离心管 、10 mL移液管。 1.2.2?操作流程 （1）用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿 囊腔的界限以及胚胎的位置。 （2）将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个 鸡胚，通常每个样本接种3个鸡胚。 （3）用75%乙醇消毒鸡胚表面，在气室端打孔器开 孔，开约6 mm×6 mm裂口。 （4）用一次性1 mL注射器吸取200 μL经多种抗生 素处理过的临床标本接种至鸡胚尿囊腔。 （5）37℃培养箱培养，每天检查鸡胚生长情况。 不同亚型的禽流感病毒培养时间不同（高致病性H5N1和 H5N6禽流感病毒的培养时间不超过40 h；H7N9禽流感病 毒培养时间72 h；H9N2禽流感病毒培养时间48 h）。 （6）收获鸡胚尿囊液。 （7）鸡胚在收获前应置4℃环境过夜或至少放置4 h。标记15 mL无菌管与相应的鸡胚编号一致。用75%乙 醇消毒鸡胚顶部。用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，用10 mL吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。 （8）将鸡胚尿囊液3 000 r/min离心5 min，进行 为深入推进我国生物资源保藏体系建设，支撑我国生物资源，特别是病原微生物资源发现、鉴定、编目、储存、共享、使用等全过程、全流程规范化工作管理，促进我国生物技术健康发展，确保国家生物安全提供有力保障。