生物化学与分子生物学实验教程(供临床预防麻醉检验药学精神卫生护理等医学类专业及生

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内容简介

第一篇 生物化学与分子生物学实验基础
　　第一章 实验室基本知识
　　第二章 常用生物化学与分子生物学技术原理
　　第一章 实验室基本知识
　　第一节 实验须知
　　一、实验要求
　　进行科学实验不仅要求高质量（结果良好）而且要求高效率，为此应注意以下几点。
　　（1）实验者在实验前需做好预习，只有在充分做好预习的条件下，实验才能获得较好的结果，这是培养同学在实验中独立工作的必要过程，每次实验前必须通过预习重点了解实验目的和要求、实验原理及主要操作步骤，特别要弄清实验设计的原理。并根据以上内容，计划好整个实验应使用的仪器、操作程序及大致的时间分配，做到心中有数，避免盲目机械地按实习指导操作。
　　（2）实验室必须保持整洁安静。
　　（3）实验者必须严肃认真、专心地进行操作，细致地观察实验现象，并从实验结果中得出正确的结论，写好实验报告。
　　二、实验原始记录与实验报告要求
　　除实验报告本外，每人必须准备一个原始记录本，一切观察的现象与实验数据必须记录在记录本上，做实验不能无记录或仅仅凭印象来描述结果。不准用碎纸记录，更严禁将原始记录涂写在手心上。这关系到一种良好的科学习惯的培养。
　　实验报告内容应该包括实验日期、名称、原理、主要操作步骤及观察结果、解释与结论。报告要用自己的话来书写，字迹端正整洁，内容简明扼要。报告一般应于两天内送交指导教师，老师批阅报告并登记入册，作为本课程实验考核成绩，因此，不能无故缺交报告，如违反规定，将酌情扣减实验成绩。
　　（骆亚萍）
　　第二节 生物化学基本操作训练
　　一、玻璃仪器的清洗
　　（1）一般容器。例如，试管、量筒及烧杯等，可直接用肥皂水或去污粉刷洗，再用自来水多次冲洗，去尽肥皂水或去污粉，最后用少量蒸馏水冲洗2次或3次，倒置沥干备用。洗净的容器内壁应是光洁不沾挂水珠。
　　（2）容量分析仪器。例如，吸量管、量筒及滴定管等，先用自来水冲洗多次，待沥干后，再用铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水充分冲洗，直到将洗液全部洗净为止，最后用少量蒸馏水冲洗2次或3次，干燥后备用。
　　二、样品的制备
　　1．血清的制备
　　静脉采血后，注入清洁干燥离心管（不加抗凝剂）中，37℃下，让血液凝固1～2h；4℃冰箱过夜让血块固缩；当血清自然析出后，4℃、3000r／min离心10r／min，弃去不溶物后所得的上清液即为血清；可将血清移至一干净试管，并分装成小份，储藏于-80℃。
　　2．血浆的制备
　　在离心管中先加入一定比例的抗凝剂（抗凝剂：血液=1：9），将血液加到一定量后颠倒数次，充分混匀，离心（离心条件同上）后所得的上清液即为血浆。可将血浆移至一干净试管，并分装成小份，储藏于-80℃。
　　3．尿液的制备
　　留取中段尿液在清洁干燥容器中，女性避开月经期。储藏于4℃。
　　4．组织样品的制备
　　请看各个具体实验。
　　三、吸量管
　　1．吸量管的种类
　　（1）奥氏吸量管。奥氏吸量管用于准确量取0.5mL、1mL、2mL、5mL及10mL液体。每根吸量管上只有一个刻度（图1-1A），放液时最后须吹出残留在管尖的液体。这类吸量管的特点是在同一容量的吸量管中以它的内表面积为最小，故准确度最高，常用于量取黏度较大的液体。
　　（2）移液管或移液吸量管。移液管用于量取1mL、5mL、10mL、20mL、25mL、50mL及100mL液体。每根吸量管上只有一个刻度（图1-1B），放液时待管内液体流出后，吸量管管尖在容器内壁上继续停留15～30s，管尖残留液体不得吹出。这类吸量管常用于化学容量分析定量稀释。
　　（3）刻度吸量管。刻度吸量管用于量取10mL以下的任意体积液体。有0.1mL、0.2mL、0.25mL、0.5mL、1mL、2mL、5mL及10mL几种。这类吸量管有刻度不到尖端者（图1-1C）和到尖端者（图1-1D）两种。因生产单位不同，有自上而下或自下而上的两种刻度法。因此，使用时应仔细分清，千万不要弄错。若使用刻度到尖端者，则在所量取的液体全部放出后，须将残留在管尖的液体吹出；若使用刻度不到尖端者，则以刻度为准。例如使用1mL吸量管吸取1mL液体时，则将液体恰巧放出至下端刻度即可，绝不可将液体放出达到最低的刻度以下。
　　图1-1 三种吸量管
　　A．奥氏吸量管；B．移液管；C、D．刻度吸量管
　　2．吸量管的使用方法
　　三种吸量管除上述几点不同外，其他操作相同，简述如下。
　　（1）拿法。将中指和拇指拿住吸量管上端，食指顶住吸量管顶端。
　　（2）取液。将吸量管插入液体内，用胶皮球吸取液体至最高刻度以上，然后迅速用食指按紧吸量管顶端，使液体不致从管内流出。
　　（3）调刻度。将已充满液体的吸量管提出液面，用碎滤纸片抹干吸量管外面的液体。然后持吸量管与地面保持垂直，放松食指控制液体缓慢地下降刚好至最上刻度（液体凹面、刻度和视线应在同一水平面上），立即按紧吸量管顶端。
　　（4）放液。放松食指，让液体缓慢地放入容器内（图1-2）。
　　图1-2 使用吸量管的姿势
　　3．吸量管的选用原则
　　（1）量取整数量液体时，应选用奥氏吸量管，若量取体积较大的液体时可用移液管。
　　（2）选用与取液量最相近的吸量管。例如，欲取0.15mL液体，应选用0.2mL刻度吸量管，而不能用0.5mL刻度吸量管。
　　（3）生物化学实验时，如几个试管需加入不同量的同一种液体，要根据加入液体的量酌情选用吸量管。例如，各管所加入的液体量分别为0.2mL、0.4mL、0.6mL及0.8mL应选用一支与最大的取液量接近的刻度吸量管，即1mL刻度吸量管。但如各管加入液体的量为1mL、2mL、5mL及8mL时，则不能选用同一支10mL刻度吸量管吸取不同的量加入各管中，而应该分别用一支1mL、2mL、5mL及10mL刻度吸量管吸取。因为用10mL刻度吸量管量取1mL、2mL甚至5mL溶液时，因管内径太大，其刻度是很难控制准确的。
　　（4）当取液量不足吸量管的满刻度时，如用1.0mL刻度吸量管量取0.6mL液体时，应选用刻度吸量管中上段刻度（指刻度到尖端者）。若用1mL刻度不到尖端者的吸量管，上、中、下段刻度都可以使用。
　　四、微量加样器
　　1．微量加样器
　　微量加样器是移液器的一种，实验室中常用于少量或微量液体的移取，吸液量为1~1000μL。不同规格的微量加样器配套使用不同大小的枪头，不同生产厂家生产的形状也略有不同，其加样的物理学原理有使用空气垫（又称活塞冲程）加样和使用无空气垫的活塞正移动（positive displacement）加样两种。两种方法的操作步骤基本一致。微量加样器属精密仪器，使用及存放时均要小心谨慎，防止损坏，避免影响其量程。
　　2．微量加样器的使用方法
　　（1）选择一支量程合适的加样器。加样器只能在特定量程范围内准确移取液体，如超出最小或最大量程，会损坏加样器并导致计量不准。
　　（2）设定容量值。有些加样器通过旋转按钮设置容量，有些则通过刻度显示。在调节量程时，如果要从大体积调为小体积，则按照正常的调节方法即可；但如果要从小体积调为大体积时，则可先调至超过量程的刻度，再回调至设定体积，这样可以保证量取的最高精确度。在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而使加样器损坏。
　　（3）选择合适的吸头装在加样器套筒上，稍微用力左右微微转动即可使吸头套紧。否则，移取的液体将少于设定的体积，或者液体会往下滴。
　　（4）取液。手握加样器，大拇指按下按钮至第一停点，将加样器垂直浸入液面2~3mm，然后缓慢平稳地松开拇指，慢慢吸入液体。停留1s，然后将吸头提离液面。用吸纸抹去吸嘴外面可能黏附的液滴。小心勿触及吸头口。
　　（5）放液。将吸头口贴到容器内壁并保持10°~40°倾斜，平稳地把按钮压到第一停点，停1～2s后，继续按压到第二停点，排出残余液体。压住按钮，同时提起加样器，再松开按钮。
　　（6）按吸头弹射器除去吸头（改用不同样本液体时必须更换吸头）。
　　3．注意事项
　　实验室基本上以使用连续可调的加样器为主。连续可调式加样器在使用时应注意以下几点，从而使加样器能发挥最佳性能。
　　（1）取液之前，所取液体应在室温（15～25℃）平衡。
　　（2）操作时要慢和稳。拇指接加样器时，有两个挡位，取液时按到第一个挡位即可，不要太用力以至于按到第二挡位。
　　（3）连续可调式加样器在取样加样过程中应注意加样吸头不能触及其他物品，以免被污染；加样吸头盒（架子）、废液瓶、所取试剂及加样的样品管应摆放合理，以方便操作、避免污染为原则。
　　（4）连续可调式加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质并把加样器调到最大量程，这样有利于加样器的保养。
　　五、溶液的混匀
　　如何使试管或离心管中先后加入的数种试剂充分混匀是生物化学实验中最常用的基本操作，通常试管内液体的混匀方法有以下几种。
　　（1）旋转法（使试管做圆周运动）。液体较多时常采用此法。右手拿试管上端，利用手腕力量使试管做圆周运动。顺时针或逆时方向转动都可以，但必须一个方向（图1-3）。
　　（2）指弹法。液体较少时可采用此法。左手持试管上端，使试管大致垂直于地面，再用右手手指轻轻弹动试管（即手指与试管壁成切线运动），使管内液体呈漩涡状转动。
　　（3）甩动法。此法只适用于少量液体的混匀。右手握住试管上端，将试管倾斜在桌面上来回迅速甩动，使管内液体呈漩涡状转动。
　　（4）倒转法与玻璃棒搅拌法。生化实验中不常采用这两种方法。
　　图1-3 旋转法
　　（骆亚萍）