免疫治疗（第四版）

作者简介

[美]昂奈（Aung Naing）,Aung Naing 是 MD安德森癌症中心研究性癌症治疗学系的教授，也是基于免疫治疗的临床试验的首席研究员。 Naing 博士专注于基础免疫生物学的临床转化，研究领域包括：识别免疫治疗反应的免疫生物标志物，预测免疫治疗的原发性和继发性耐药性，开发免疫治疗策略以克服耐药性，以及 确定与免疫疗法相关的免疫相关不良事件 (irAE) 的预测标志物。

内容简介

第1章　工作中的免疫系统 贝齐·斯蒂芬，朱德·哈亚尔 （Bettzy Stephen and Joud Hajjar） 摘要　肿瘤是一个具有进化能力和逃避宿主免疫监视机制能力的复杂结构网络。在肿瘤的核心、浸润性边缘、邻近的间质或淋巴样成分中存在免疫环境，包括巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、肥大细胞、B细胞和T细胞。免疫浸润具有异质性，同一患者体内和具有相同肿瘤组织学的患者之间人免疫浸润特征是不同的。肿瘤微环境中免疫细胞的位置、密度、功能和相互作用影响癌症患者免疫反应的性质、预后和治疗效果。因此，了解免疫细胞的特性及其在肿瘤免疫监视中的作用，对于识别免疫靶点和开发新的免疫疗法治疗肿瘤具有至关重要的作用。本章概述了人类免疫系统的各个组成部分以及预测性生物标志物的转化价值。 关键词　免疫细胞；癌症；细胞因子；固有性；适应性；检查点 人体免疫系统是一个复杂、动态的细胞网络，这些细胞协同作用以保护人体免受包括恶性细胞在内的外来病原体的攻击。免疫应答分为固有免疫和获得性免疫两大类。固有免疫是抵御病原体的第一道防线，包括解剖和生理屏障、吞噬性白细胞、树突状细胞（dendritic cells，DCs）、自然杀伤（natural killer，NK）细胞和循环血浆蛋白［1］。自然免疫之父、病理学家埃利·梅契尼可夫（Elie Metchnikoff）最先描述了白细胞募集和微生物吞噬的概念［2］。获得性免疫系统是由B淋巴细胞和T淋巴细胞提供的一种更多功能的防御机制，它基于物理学家保罗·埃尔利希（Paul Ehrlich）描述的抗体形成侧链理论［3］。固有免疫和获得性免疫是人类免疫系统中截然不同但相辅相成的组成部分，共同发挥作用抵御外来蛋白质［4］。本章将讨论免疫系统的基本组成部分及其发育过程、固有免疫如何与获得性免疫反应相互作用以消除肿瘤细胞，以及抗癌免疫治疗策略的发展。 ?1?　固有免疫系统 炎症与肿瘤发生之间的联系由来已久，但在21世纪之交才得到证实［5］。人体每天都会不断地接触到高度多样化的外来蛋白质，这些蛋白质在正常健康的个体内会被固有免疫系统的组成部分迅速消除。发挥效应迅速是固有免疫应答的重要特征，但固有免疫应答是非特异性的，持续时间有限，并且缺乏免疫记忆［6］。传统上，固有免疫系统的细胞成分包括巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、NK细胞和树突状细胞，它们能够清除微生物因子，并且在清除失败时可以激活更有效的抗原特异性获得性免疫应答［4，6］。此外，固有免疫系统体液成分中的补体蛋白和C反应蛋白被认为是炎症过程的调节因子［4］。然而，越来越多的证据表明，由肿瘤抗原触发的固有免疫和获得性免疫系统在识别和消除恶性细胞方面也发挥着重要作用［7］，在此过程中会释放出一些有害的活性化学物质、细胞因子和趋化因子，从而损害周围的健康组织［8］。炎性微环境也会诱导基因组不稳定并加快分子变异的速度［9］，细胞反复更新和增殖导致的过程为慢性炎症奠定了基础，从而产生了有利于细胞恶性转化的微环境［10］。因此，肿瘤有时被描述为“无法愈合的 伤口”［11］。 1.1 固有免疫系统的细胞成分 免疫系统的所有细胞均源自骨髓中的多功能造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）。HSCs分化产生共同淋巴祖细胞（common lymphoid progenitor，CLP）和共同髓系祖细胞（common myeloid progenitor，CMP）。CLP产生负责获得性免疫应答的T淋巴细胞和B淋巴细胞以及NK细胞，而CMP则产生固有免疫系统的细胞，包括白细胞（中性粒细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞）、肥大细胞、树突状细胞、红细胞和巨核细胞。 1.1.1 白细胞 白细胞的主要功能是保护机体免受微生物入侵。然而，炎症部位的微环境因素导致单个细胞的表型和功能状态发生重大变化，从而有利于肿瘤的发生和发展［12，13］。 1.中性粒细胞 中性粒细胞占循环白细胞的50%～70%［14］，并形成了对抗病原微生物必需的第一道防线。它们起源于骨髓中的CMP细胞，可以对包括粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony - stimulating factor，GM-CSF）在内的数种细胞因子产生反应［14，15］。它们作为休眠细胞在血液中循环，并被特定的趋化因子、细胞因子和细胞黏附分子招募到感染部位［16］，然后通过吞噬作用摄取微生物，并被高浓度的杀菌颗粒或在病原体包涵囊泡中通过呼吸爆发产生的大量高毒性的活性氧所杀灭［14］。此外，活化的中性粒细胞中细胞因子［包括肿瘤坏死因子α、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-1Rα、IL-12和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）］和趋化因子（包括IL-8）的表达上调，这对募集和趋化其他中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞至关重要［17，18］。 中性粒细胞除了典型的专职吞噬细胞功能之外，它在肿瘤生物学中也发挥着重要作用［1，19］。中性粒细胞被肿瘤局部产生的如IL-8、巨噬细胞炎性蛋白1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α/CCL3）和人粒细胞趋化蛋白2（human granulocyte chemotactic protein-2，HuGCP-2/CXCL6）的趋化因子招募到肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中［20］。肿瘤相关中性粒细胞（tumor-associated neutrophils，TANs）在分子水平上表现出相反的双重作用，这与初始的中性粒细胞有明显的区别［20］，它们有的具有抗肿瘤形成（N1）表型，有的具有促肿瘤形成（N2）表 型［14，21］。在肿瘤未经治疗时，肿瘤细胞中的调节性细胞因子转化生长因子β（transforming growth factor-beta，TGF-β）驱动TANs向N2表型分化［13］。这些中性粒细胞在局部产生中性粒细胞弹性蛋白酶（elastase，ELA2）［22］、抑癌素M［23］和警报素S100A8/9［24］，促进肿瘤细胞的增殖、存活、转移和化疗耐药性。另外，N2型TANs通过释放生长刺激信号、血管生成因子和基质降解酶来促进免疫抑制和肿瘤进展［13，20，25］。此外，还发现乳腺癌患者外周血中具有促肿瘤N2样表型的中性粒细胞在循环肿瘤细胞周围形成簇状［26］。这些中性粒细胞-循环肿瘤细胞群加速了血行转移的发展，导致总生存期缩短。因此，中性粒细胞在肿瘤细胞的发生和发展中扮演多种角色［27］。然而，在某些条件下，如TGF-β阻断，TANs呈现N1表型。在这种表型中，免疫激活细胞因子和趋化因子的表达增强以及精氨酸酶水平降低，因而其细胞毒性更强［13］。N1型TANs还能与树突状细胞相互作用来触发获得性免疫应答［28］，它们通过产生趋化因子（如CCL3、CXCL9和CXCL10）和促炎细胞因子（即IL-12、TNF-α、GM-CSF和VEGF）促进肿瘤内CD8+T细胞浸润和活化［29］。这种表型能抑制肿瘤的发展，表明通过阻断TGF-β来实现免疫刺激是有可能性的［13］。 2.单核细胞和巨噬细胞 单核细胞是来源于CMP细胞，它们是体积较大的单细胞核细胞，占循环白细胞的5%～7%。这些单核细胞迁移到组织中，依靠组织的活化作用迅速成熟并分化为不同的巨噬细胞，如表皮中的朗格汉斯细胞、肝脏中的库普弗细胞和中枢神经系统中的小胶质细胞［30］。巨噬细胞具有许多功能，它们主要吞噬并摧毁入侵的微生物。它们还会释放细胞因子和趋化因子，将免疫系统的其他细胞招募到炎症部位。巨噬细胞还诱导抗原提呈细胞（antigen-presenting cells，APCs）上的共刺激分子表达，启动获得性免疫反应，并协助清除被获得性免疫反应破坏的病原体［2］。 与TANs相似，单核细胞被CCL2、CCL5、CCL7和CCL8等肿瘤源性趋化因子或血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、TGF-β、GM-CSF和M-CSF等细胞因子［31-34］招募到TME中，然后分化成为组织驻留巨噬细胞［35］。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）的功能具有可塑性，它既可以呈现出抗肿瘤的M1表型（经典激活），又可以呈现出促肿瘤的M2表型（交替激活）［36］。TME中的细胞因子谱对巨噬细胞分化的表型方向起到核心作用［37］。总体而言，存在于TME中的主要细胞因子M-CSF、TGF-β和IL-10对TAMs的IL-12产生和NF-κB激活起着强烈的抑制作用［38］，这使得单核细胞倾向分化为M2表型巨噬细胞，其特征是IL-12低、IL-10高［31，39］。这些巨噬细胞迁移到肿瘤内的缺氧区域，并通过多种方式促进肿瘤进展，包括表达VEGF、血管生成素、促血管生成细胞因子和IL-1等因子诱导血管生成，通过产生多种基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）如MMP1和MMP9来重塑基质，以及通过产生前列腺素、IL-4、IL-6、IL-10、TGF-β、吲哚胺2，3-双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）代谢物和诱导调节性T（T regulatory，Treg）细胞来抑制获得性免疫［34，39］。 这使得肿瘤细胞能够逃逸瘤细胞具有选择或促进作用，后者能够逃脱免疫系统的识别［169］。这是免疫编辑过程中经历时间最长的阶段，在变异肿瘤细胞最终发生逃逸以前一直处于潜伏状态［170］。 在逃逸阶段，肿瘤细胞采用几种机制来逃避免疫监视［171］。肿瘤细胞下调肿瘤抗原或MHCⅠ类分子的表达，来减少免疫识别和提呈至肿瘤特异性T细胞的抗原，从而阻止T细胞的激活。肿瘤细胞也可以上调促生存生长因子如EGFR和HER2的表达。此外，肿瘤细胞经常进化出大量免疫抑制防御机制——通过一种被称为免疫耐受的过程，来逃避免疫监视［7］。例如，肿瘤细胞可以表达抑制性表面配体PD-L1或PD-L2，其与活化T细胞上的PD-1受体结合，导致T细胞的衰竭或免疫抑制分子（如IDO）的释放［172］。在缺氧条件下，TME可以释放VEGF，用以抑制T细胞与肿瘤内皮的黏附，并阻碍肿瘤T细胞的浸润。相似地，TAMs在出现IL-4、IL-10和TGF-β时可以极化以产生M2表型，并表达高水平的IL-10和低水平的IL-12。这些巨噬细胞抑制T细胞活性并促进血管生成和肿瘤生长［173］。此外，TME中不成熟的固有免疫细胞MDSCs利用各种机制如IL-10、TGF-β及Tregs的表达，产生免疫抑制，导致肿瘤进展［174，175］。结果就是，免疫压力筛选使肿瘤细胞产生了更高的耐受性，导致肿瘤生长失控，并伴有明显的临床疾病。因此，克服这些障碍以激发治疗药物的临床疗效是非常关键的。 ?4?　癌症免疫疗法 多年来，肿瘤治疗领域不断进展。早期通过对一些细胞因子的研究，最终获得美国食品和药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）的批准，将IFN-α用于治疗毛细胞白血病以及高剂量IL-2用于治疗肾细胞癌和转移性黑色素瘤［176］。但是，由于这些方法可引起全身性毒性、触发免疫检查点、激活Tregs细胞和MDSCs，从而使其在抗肿瘤应用方面受到限制。最近，研究者发现IL-2通路的一种激动剂NKTR-214，能在肿瘤微环境中选择性地激活并扩增CD8+T细胞和NK细胞而不会扩增Tregs细胞，且能增加细胞表面的PD-1表达［177］。基于以上发现，临床正在开展NKTR-214和PD-1抑制剂纳武单抗联合用于未接受过免疫治疗的黑色素瘤、肾细胞癌、非小细胞肺癌（NSCLC）和尿路上皮癌患者的治疗研究（Ⅱ期PIVOT2临床研究）。在该研究中黑色素瘤队列的38名可评估疗效的患者中，获得的客观缓解率（overall response rate，ORR）和疾病控制率分别为53%和76%［178］。与高剂量IL-2疗法相比，这种治疗产生的细胞因子相关不良事件级别低且易于控制。 一般情况下，IL-10是一种免疫抑制性抗炎症分子。然而，使用聚乙二醇化IL-10（Pegilodecakin）可获得更高浓度的IL-10，增强了CD8+T细胞的肿瘤内浸润和细胞毒活性［179］。此外，IL-10诱导CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分泌IFN-γ，使TME中的MHC分子的表达上调，导致小鼠模型对已建立的肿瘤发生排斥反应。在难治性肿瘤患者中，对Pegilodecakin的临床活性进行的研究结果表明，Pegilodecakin对肾细胞癌和葡萄膜黑色素瘤有显著的抗肿瘤活性［180］。当Pegilodecakin与PD-1抑制剂［181］或FOLFOX联合使用时［182］，能分别在治疗非小细胞肺癌和胰腺癌中产生疗效。在转化研究中发现，当Pegilodecakin诱导血清中的Th1和Th2细胞因子持续升高时，可导致免疫抑制细胞因子TGF-β和Th17相关细胞因子减少，从而介导肿瘤相关的炎症反应［183］。值得注意的是，这些变化在整个治疗过程中持续存在，且在不同肿瘤类型中保持一致。此外，Pegilodecakin能引起CD8+T细胞克隆性增殖，并使其在T细胞谱系中占据相当大一部分比例，这种现象在正常基线情况下是不存在的。这种新颖的作用机制与诱导长效免疫记忆的共同作用可产生持续且客观的抗肿瘤反应。此外，通常与免疫治疗药物引起的免疫相关不良反应［180］显著减少，因此Pegilodecakin是一种值得进一步探索的潜在抗肿瘤药物。 IL-6是一种在多种肿瘤中过度表达的细胞因子，与肿瘤的侵袭性生长和不良预后相关［184］。此外，IL-6通过激活下游的JAK/STAT3信号通路对肿瘤浸润免疫细胞产生深远的负面影响，从而形成免疫抑制性TME［185］。另外，化疗药物会引起IL-6表达上调，这可导致肿瘤患者对抗癌治疗产生耐药性。因此，靶向IL-6有可能成为治疗肿瘤的一种潜在方案。FDA已批准司妥昔单抗（IL-6抑制剂）、托珠单抗（IL-6受体抑制剂）和鲁索利替尼（JAK1/JAK2抑制剂）等药物用于治疗多中心型Castleman病、嵌合抗原受体（CAR）T细胞诱导的细胞因子释放综合征和骨髓纤维化/真性红细胞增多症。靶向IL-6/JAK/STAT3信号通路的药物正在进行实体瘤治疗的临床研究。 IL-8是另一种在多种肿瘤包括乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、胃癌、肺癌和卵巢癌中过度表达的细胞因子［186］。IL-8信号传导可以促进肿瘤生长、血管生成、上皮-间质转化以及髓源性抑制细胞的募集。较高水平的IL-8与疾病的进展、分级以及更高的肿瘤负荷相关。在对晚期肾细胞癌、黑色素瘤或非小细胞肺癌患者进行的四项免疫检查点抑制剂（ICPis）的Ⅲ期临床试验的回顾性分析表明，较高的基线血清IL-8水平与不同肿瘤类型的低生存率相关［187］。这一发现表明IL-8可以作为ICPis治疗耐药的生物标志物。靶向IL-8的药物正在临床开发中。在对患有不可治愈的转移性肿瘤或无法切除的实体肿瘤患者进行的Ⅰ/Ⅱ期临床研究中［188］，使用HuMax-IL8（BMS-986253；全人源IgG1κ单克隆抗体）治疗的15例患者中有11例病情得到了控制。目前IL-8阻断联合疗法正在不断研究中。 IL-12是一种由APCs产生的多效性促炎症细胞因子［189］。尽管它在临床前研究中展现了强大的免疫激活潜力和显著的抗肿瘤活性，但由于其剂量限制毒性和在可耐受剂量下的疗效有限，使IL-12的全身使用受到了限制［190，191］。目前，几项临床试验正在研究新的局部IL-12递送策略，以提高早期肿瘤患者中IL-12的浓度。其中值得注意的是免疫细胞因子NHS-IL-12，它是一种含有IL-12和肿瘤结合抗体的融合蛋白。这种药物虽然会导致一过性的淋巴细胞减少和肝脏转氨酶升高，但人体对其耐受性很好。尽管它增加了NK细胞数量和TILs中TCR的多样性，但研究者并没有观察到客观反应［192］。NHS-IL-12与ICPi药物阿维鲁单抗的联合使用也在研究中。其他方法包括利用质粒、mRNA、病毒、转导细胞在肿瘤内递送编码IL-12的遗传物质，以及通过直接植入肿瘤递送系统来控制重组IL-12的释放。在一项Ⅱ期临床研究中，利用电穿孔注射的方法将含有编码IL-12的DNA质粒（pIL-12）递送到转移性或M1a黑色素瘤患者的肿瘤中，33%的患者有客观反应，其中11%的患者有完全反应［193］。重要的是，使用这种方法并没有出现治疗相关的3级或4级不良反应。在同一项研究中，35.7%的晚期黑色素瘤患者有客观反应，其中17.9%的患者有完全反应［194］。基于IL-12的联合疗法作为化疗、放疗和消融疗法的新辅助及辅助疗法，目前正处于早期研发阶段。IL-12与ICPis联合使用也具有良好的协同作用。在一项Ⅱ期研究中，经电穿孔法将pIL-12注射入非浸润性黑色素瘤患者的肿瘤中，并联合使用ICPi药物派姆单抗，41%的患者有客观反应，其中36%的患者有完全反应［195］。 IL-27是一种与IL-6家族结构相似的IL-12家族细胞因子［196］。它不但可以直接抑制肿瘤细胞的增殖、存活、血管生成和侵袭特性，还能促进NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞的发育，从而通过多种机制促进抗肿瘤免疫［197］。由于IL-27可通过增强NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力，使APCs更容易捕获肿瘤抗原。因此IL-27起到了连接人体固有免疫系统和获得性免疫系统的关键作用。与IL-12不同的是，在临床前研究中发现IL-27的抗血管生成作用不依赖于IFN-γ的作用，因而毒性较小。但是，IL-27却可通过诱导PD-L1、TIM3和IDO的表达来降低肿瘤特异性T细胞反应，从而抑制其抗肿瘤活性。在小鼠模型中，使用表达IL-27的重组腺相关病毒（AAV-IL-27）会导致Tregs细胞快速耗竭，并显著抑制了多种肿瘤类型肿瘤的生长［198］。在两种肿瘤模型中发现，IL-27基因疗法与抗PD-1的联合治疗可导致肿瘤完全消退，提示了IL-27在抗肿瘤治疗中的潜在作用。 IL-15是一种与IL-2一样具有多种共同作用的促炎症细胞因子。尽管这两种细胞因子都通过刺激细胞毒性CD8+T细胞和NK细胞的增殖来增强抗肿瘤反应［199］，但是IL-15不会对Tregs细胞产生重大影响，且分泌量很少。由于IL-15在临床前研究中表现出优异的抗肿瘤作用，因此使用重组人IL-15（rhIL-15）通过静脉注射、皮下注射和连续性静脉输注方法进行了首次人体试验［200］。其中，当rhIL-15以静脉注射的方式给药时，因其严重的毒性导致研究终止。而在其他用药途径中，虽然IL-15引起了血循环和肿瘤内CD8+T细胞和NK效应细胞的显著扩增，但由于它诱导了CD8+T细胞的检查点TIGIT、TIM3、IL10和PD-1表达，并且NK细胞无法特异性靶向肿瘤细胞，导致其仅能产生较弱的抗肿瘤反应［201］。为了克服这个问题，目前正在进行基于IL-15的药物联合试验（包括病灶内抗CD40激动剂、检查点抑制剂、抗CTLA-4和抗PD-L1，以及靶向肿瘤的单克隆抗体）［202］。 IL-18是IL-1细胞因子家族的成员。尽管IL-18在TILs中的表达上调，但重组IL-18并没有在黑色素瘤中产生预期的疗效［203］。这是因为在肿瘤中存在高水平的“诱饵受体”IL-18BP，可通过极强的亲和力与IL-18结合，从而削弱了IL-18诱导免疫反应的能力［204］。目前，已经制造出一种完整保留了IL-18受体信号通路的“抗诱饵”IL-18变体（DR-18），并且正在实体肿瘤患者中对它进行测评。 细胞因子与自身免疫性疾病的发病机制有关。由于在进行免疫治疗的过程中，免疫相关不良反应可能是由于自身免疫反应导致的［205］，因此正在研究通过阻断细胞因子来控制这些毒性作用的方法。在免疫治疗引起的皮肤病（银屑病）和胃肠道毒性中，阻断IL-17和肿瘤坏死因子是具有前 景的［206，207］。 已经有多种单克隆抗体用于治疗肿瘤［208］，如能抑制配体结合和下游信号通路的西妥昔单抗、靶向肿瘤微环境的贝伐珠单抗，以及靶向免疫抑制细胞因子的GC-1008（一种抗TGF-β的抗体）［209］。但是，正是免疫检查点的发现和对免疫调节通路的深入了解，才产生了肿瘤免疫治疗的重大突 破［210］。在发现活化T细胞能表达CTLA-4，并通过结合APC膜上的B7分子阻断T细胞共刺激从而导致免疫抑制这一现象后，进行了一系列通过释放T细胞的免疫调节能力来治疗肿瘤的研究。这使免疫检查点阻断的治疗理念得到了发展，并突破性地发现了伊匹单抗这一CTLA-4抑制剂，由于该单抗在20%的转移性黑色素瘤患者中，使疾病持续缓解和总生存期中位数显著提高，因此在2011年被FDA批准用于治疗转移性黑色素瘤患者［211］。伊匹单抗激动人心的效果为探索其他T细胞抑制通路奠定了基础。基于强有力的临床前证据，进行了几项临床试验来评估单克隆抗体阻断PD-1/PD-L1通路的疗效［212-216］。由于这一疗法在几种癌症中取得了持续性缓解和生存获益，FDA加速批准了几种ICPis作为单一疗法（表1.1）［217］。 表1.1　FDA批准的免疫检查点抑制剂和适应证a 药物 免疫检查点 FDA批准的肿瘤类型b 伊匹单抗 CTLA-4 黑色素瘤 纳武单抗 PD-1 黑色素瘤 非小细胞肺癌 小细胞肺癌 肾细胞癌 经典型霍奇金淋巴瘤 头颈部鳞状细胞癌 尿路上皮癌 肝细胞癌 错配修复缺陷和微卫星不稳定性高转移结直肠癌 食管鳞状细胞癌 帕博利珠单抗 PD-1 黑色素瘤 非小细胞肺癌 食管鳞状细胞癌 小细胞肺癌 头颈部鳞状细胞癌 经典型霍奇金淋巴瘤 尿路上皮癌 胃或胃食管交界处癌 微卫星高不稳定性或错配修复缺陷固态瘤 宫颈癌 默克尔细胞癌 肝细胞癌 皮肤鳞状细胞癌 三阴性乳腺癌 高肿瘤突变负荷（TMBH）［≥10个突变/兆碱基（Mut/Mb）］实体瘤 阿特珠单抗 PD-L1 尿路上皮癌 非小细胞肺癌 PD-L1阳性三阴性乳腺癌 德瓦鲁单抗 PD-L1 尿路上皮癌 非小细胞肺癌 阿维鲁单抗 PD-L1 默克尔细胞癌 尿路上皮癌 西米普利单抗 PD-L1 皮肤鳞状细胞癌 基底细胞癌 非小细胞肺癌 注：a：截至2021年3月17日FDA批准的免疫检查点抑制剂列表，改编自https：//www.fda.gov/drugs/resources-information-approved-drugs/hematologyoncology-cancer-approvals-safety-notifications。 ??b：肿瘤类型必须符合上述网站列出的标准。 尽管ICPis（CTLA-4抑制剂、PD1-/PD-L1抑制剂）在多种肿瘤治疗中取得了较好的抗肿瘤效果，但仍然有许多患者对该治疗有初始耐药性或者在初期缓解后继发耐药［218］。在几种正处于临床研究阶段、克服肿瘤对ICPis的初始和继发耐药性的治疗策略中，积累了越来越多的证据表明联合疗法在对抗肿瘤耐药机制方面比单一疗法更加有效，降低了肿瘤使用多种机制逃避免疫清除的机会［219］。此外，由于这些共抑制受体具有非冗余的信号通路，因此联合阻断这些机制上不同的信号通路可能对恢复T细胞介导的免疫反应有协同作用［147］。有深入研究发现了能够提高治疗反应率和反应时间的联合治疗优化方案。靶向治疗可以使肿瘤快速消退［220］，但这种效果是短暂的。与之对比，免疫治疗虽需要更长的时间才能激发肿瘤消退，但其效果更加持久。因为两者具有互补的效果，有多个联合使用靶向疗法和免疫疗法的临床试验研究正在进行中，新的数据表明这种联合疗法可能具有协同作用［221］。表1.2列出了FDA已批准的基于ICPis的联合疗法。相似地，放射诱导的免疫调控变化虽然能够达到肿瘤局部控制和延长患者生存期的效果，但并不足以逆转免疫抑制性TME的平衡产生的肿瘤排斥效应［222］。为了克服这一不足，临床研究正在评估放射疗法和ICPis联合应用的疗效［223，224］。此外，阻断下一代共抑制受体Lag-3、Tim-3和TIGIT的研究也正在积极进行中［147］。 除了CTLA-4和PD-1/PD-L1信号通路外，其他免疫调节通路也作为潜在治疗靶点在进行研究。IDO是一个免疫抑制性通路，被肿瘤细胞用来逃避免疫监视［225］。几种IDO抑制剂正被作为单药和与PD-1抑制剂及化疗联合使用进行研究，例如INCB024360［226，227］、吲哚莫德［228］、IDO肽疫苗［229］、BMS-986205［230］和NLG919［231］。尽管在早期临床试验中的成果可喜，但在一项艾卡哚司他和派姆单抗联合用于黑色素瘤患者的Ⅲ期临床试验中，却未能重现其疗效［232］。 表1.2?FDA批准的基于免疫检查点抑制剂的药物组合和适应证a 药物 免疫检查点 FDA批准的肿瘤类型b 纳武单抗和伊匹单抗 PD-1和CTLA-4 黑色素瘤 肾细胞癌 微卫星高不稳定性和错配修复缺陷结直肠癌 肝细胞癌 恶性胸膜间皮瘤 非小细胞肺癌 纳武单抗和伊匹单抗以及两个周期的铂双重化疗 PD-1和CTLA-4 非小细胞肺癌 纳武单抗和卡博替尼 PD-1 肾细胞癌 纳武单抗和卡铂以及紫杉醇或白蛋白结合型紫杉醇 PD-1 鳞状非小细胞肺癌 帕博利珠单抗和阿西替尼 PD-1 肾细胞癌 帕博利珠单抗和乐伐替尼 PD-1 非微卫星高不稳定性或错配修复缺陷性子宫内膜癌 阿特珠单抗和贝伐单抗、紫杉醇以及卡铂 PD-L1 非鳞状，非小细胞肺癌 阿特珠单抗和卡铂以及依托泊苷 PD-L1 小细胞肺癌 阿特珠单抗、白蛋白结合型紫杉醇和卡铂 PD-L1 肝细胞癌 阿特珠单抗和考比替尼以及威罗非尼 PD-L1 黑色素瘤 阿维鲁单抗和阿西替尼 PD-L1 肾细胞癌 杜瓦鲁单抗和依托泊苷以及卡铂或顺铂 PD-L1 广泛期小细胞肺癌 注：a：截至2021年3月17日FDA批准的免疫检查点抑制剂列表，改编自https://www.fda.gov/drugs/resources-information-approved-drugs/hematologyoncology-cancer-approvals-safety-notifications。 ??b：肿瘤类型必须符合上述网站列出的标准。 产生强效的治疗性免疫反应不仅要松开T细胞上的“刹车”，也要踩住T细胞上的“油门”。T细胞在OX40、4-1BB、CD40或GITR（糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体）等受体的共刺激作用下，能够产生一种强力的“启动”信号，促进最佳“杀手”CD8+T细胞的反应［233］。几项正在进行的临床试验正在研究免疫检查点激动剂作为单药或与其他免疫疗法、化学疗法、靶向疗法或放射治疗联合使用的效果。虽然使用T细胞激动剂治疗通常具有良好的耐受性，这类药物最常见的不良反应是疲劳和与输液有关的反应。但是，在一项Ⅱ期临床研究中报道了两例肝毒性相关的死亡，该研究使用了4-1BB激动剂（剂量分别是1 mg/kg每三周一次和5 mg/kg每三周一次），死亡案例导致了该研究于2009年终止［234］。不过，这项研究于2012年以较低的剂量水平（0.1 mg/kg每三周一次和0.3 mg/kg每三周一次）被重启，并被发现是安全的。在实体瘤患者中，单一疗法的抗肿瘤活性在最佳时也只是中等［233］。但是，当T细胞激动剂和ICPis联合使用时，已经观察到反应率有所改善。据报道，在联合使用乌托米单抗（4-1BB激动剂）和派姆单抗（ICPi）治疗肿瘤时，患者的ORR为26.1%［235］；联合使用乌瑞芦单抗（4-1BB激动剂）和纳武单抗治疗肿瘤时，患者的ORR为50%［233］。另外，在使用CP-870893（CD40激动剂）联合吉西他滨治疗的胰腺癌患者中，部分缓解率为19%，病情稳定率为52%；用CP-870783（CD40激动剂）联合紫杉醇和卡铂治疗的实体瘤患者中，部分缓解率为20%，病情稳定率为40%。在一项新辅助研究中，10名接受乌瑞芦单抗（4-1BB激动剂）和纳武单抗联合GVAX疫苗治疗的胰腺癌患者中，有9名在中位随访12个月后无病生存［236］。 随着以免疫治疗为基础的联合疗法研究越来越多，确定最佳组合策略仍然是一项挑战，因为给药的时机和顺序都可能影响治疗结果。例如，大多数乳腺癌患者对PD-1抑制剂单药治疗没有反应。由于已知TILs在乳腺癌中表达OX40，所以研究者在PD-1难治性小鼠乳腺癌模型中研究了抗PD-1和OX40激动剂组合的作用［237］。发现两种药物同时给药时，产生的抗肿瘤反应较弱持续时间短，而先后使用这些药物时，抗肿瘤反应不仅持久，且超过30%的小鼠更是表现出了完全缓解。此外，免疫治疗的时机对于改善治疗结果也非常关键。比如，在结直肠癌肿瘤小鼠中研究了放射联合免疫疗法的治疗效果［238］。在放疗后抗原提呈增加的窗口期立即施用OX40激动剂时，可以获得最佳效果［238］，而在放射前使用抗CLTA-4时最有效。因此，当联合使用时，应注意免疫治疗药物施用的顺序和时机。 新的数据表明，激活固有免疫系统可能会破坏TME的免疫抑制稳态，从而引发有效的抗肿瘤免疫反应。重要的是，这个过程通过增强T细胞的启动而引发获得性免疫反应。Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）作为固有免疫系统中最重要的受体，在肿瘤中表现出双重作用［239］。虽然肿瘤细胞上的一些TLRs有利于肿瘤的生长［240，241］，且会促进肿瘤细胞对化疗的耐药性，但免疫细胞上大多数TLRs是作为传感器存在的［239］。当通过外源性抗原激活这些TLRs时，会触发一系列促炎症反应，最终引发获得性免疫反应。因此，TLRs被确定为潜在靶点，一些TLR激动剂（TLR3、TLR4、TLR5和TLR7激动剂）正在被研究用于临床应用［242，243］。同样，在APCs中高表达的内质网膜蛋白STING（干扰素基因刺激因子）通过诱导固有免疫系统和启动获得性免疫系统，来介导有效的抗肿瘤活性［243］。通常，自体DNA位于细胞核或线粒体中，而微生物/肿瘤来源的DNA位于细胞质内。根据它们位置的特点，肿瘤来源的DNA由几种胞浆DNA传感器识别，这些传感器触发APCs中的STING信号激活［244］。通过STING信号通路产生的下游信号导致干扰素调节因子3 （IRF3）和核因子-κB的磷酸化，进而诱导促炎症因子、TNF-β，以及TNF、IL-1β、IL-6等细胞因子。在此过程中，IFN还能促进DCs对T细胞的交叉启动，从而引发获得性免疫反应［245］。由于STING信号通路的激活可促进T细胞启动和诱导获得性免疫机制，目前正在研究几种STING激动剂作为疫苗佐剂与其他免疫调节剂的组合［246-248］。巨噬细胞是固有免疫系统中的细胞，对TME中的细胞因子起着双刃剑的作用［249］。通常，在IFN-γ存在的情况下，TAMs获得M1表型并具有肿瘤特异性。然而，在缺氧的TME中，TAMs获得促肿瘤M2表型，并参与肿瘤细胞的增殖和迁移。因此，TAMs是潜在的治疗靶点。使用CSF1R抑制剂减少TAMs招募或耗尽TAMs［249，250］，以及使用生物耦联的二氧化锰纳米粒子［251］或铁氧体纳米粒子［252］或同时使用CSF-1R阻断和CD40激动剂［253］对TAMs重新编辑使其获得M1样抗肿瘤表型，这些策略也正在进行研究。综上看来，结合固有免疫和获得性免疫反应的治疗策略可能具有治疗效用。 在肿瘤治疗中，除了针对固有免疫和获得性免疫系统的组成细胞外，调控代谢通路来诱导免疫到周围的间质中并最终转移到远处。然而，巨噬细胞在例如GM-CSF、微生物产物、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）或干扰素（interferon，IFN）-γ存在的情况下发生经典性激活，TAMs会呈现出更加具有细胞毒性、抗原提呈功能、高IL-12和低IL-10的M1表型［34］。它们通过产生大量的促炎细胞因子［如IL-12和IL-23、有毒中间体——一氧化氮、活性氧中间体（reactive oxygenintermediates，ROI）和TNF］来杀死微生物和肿瘤细胞［31，34］。 细胞因子还启动辅助性T细胞1（T-helper 1，Th1）获得性免疫。虽然在乳腺癌［40，41］、膀胱癌［42］、 子宫内膜癌［43］和宫颈癌［44］中，高数量的巨噬细胞往往与患者预后不良有关，但肿瘤组织中的TAMs为前列腺癌［45］和结肠癌［46］患者提供了生存优势。巨噬细胞表型从M2向M1的药理学转变可能为癌症患者带来治疗获益。据报道，蜂毒中的一种主要多肽蜂毒素能选择性减少M2样TAMs、提高M1/M2比率，因而具有抗肿瘤特性［47］。此外，当蜂毒素与线粒体膜破坏肽dKLA融合时，会选择性地诱导原位肺癌模型中M2样巨噬细胞凋亡。这些发现提供了一种靶向TME中TAMs的新治疗方法［48］。目前，减少或耗尽TAMs、将TAMs重新极化为M1样巨噬细胞以及促进TAMs吞噬功能等一些治疗策略正在研发中。例如，集落刺激因子1（colony-stimulating factor 1，CSF1）与其受体（CSF 1 receptor，CSF 1R）结合是通过招募TAMs来促进免疫抑制，在晚期癌症患者中对CSF 1R抑制剂AMG 820进行了首次人体Ⅰ期研究［49］，在可评估疗效的患者中有32%观察到中等程度的抗肿瘤活性。另一种正在评估的抗TAM策略是抑制肿瘤细胞上表达的CD47（“别吃我”信号）与巨噬细胞表面信号调节蛋白α（signal-regulatory protein alpha，SIRPα）的结合。人源化抗CD47抗体Hu5F9-G4与抗CD20抗体利妥昔单抗的联合使用已在侵袭性和惰性淋巴瘤患者以及卵巢和输卵管癌患者中显示出良好的活性［50］。 3.嗜酸性粒细胞 嗜酸性粒细胞来源于CMP细胞，它们占循环白细胞的比例不足5%［2，51］。传统上，嗜酸性粒细胞与宿主防御大型多细胞寄生虫和致过敏性疾病的真菌有关［52］。嗜酸性粒细胞可以表达多种受体，例如趋化因子受体、细胞因子受体、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）受体、Toll样模式识别受体和组胺受体等［53］。这些受体的结合可使细胞释放高细胞毒性蛋白质，如主要碱性蛋白、嗜酸性粒细胞衍生神经毒素或嗜酸性粒细胞过氧化物酶（eosinophil peroxidase，EPO）、促炎性细胞因子和生长因子（IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、TGF-α/β）、趋化因子［RANTES（CCL5）、eotaxin-1（CCL11）CXCL5］以及来自过敏性炎症部位的高度细胞毒性的、分泌型胞浆大颗粒的脂质介质（血小板激活因子和白三烯C4）［53，54］。 此外，在肿瘤浸润区也发现了嗜酸性粒细胞［1］。肿瘤相关组织嗜酸性粒细胞增多可以改善多种实体肿瘤患者的预后，这些实体肿瘤包括结直肠癌［55］、口腔鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）［56］，以及喉癌和膀胱癌［57］。尽管在肿瘤中嗜酸性粒细胞作用尚不清楚，但已经很明显的是，嗜酸性粒细胞表达Ⅱ类主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）和共刺激分子［CD40、CD28/86、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）］［58，59］，它们可以作为APCs发挥作用并通过T细胞来启动抗原特异性免疫反应［60］。动力学研究表明，坏死肿瘤细胞释放的嗜酸性粒细胞趋化因子、损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）等趋化因子诱导嗜酸性粒细胞在CD8+T细胞浸润之前迁移至肿瘤内［61-63］。活化的肿瘤相关组织嗜酸性粒细胞释放如CCL5、CXCL9和CXCL10等趋化因子，将CD8+T细胞招募至肿瘤中［64］。在肿瘤特异性CD8+T细胞存在的情况下，肿瘤相关组织嗜酸性粒细胞增多会引起TME发生显著变化，例如TAM向M1表型分化和肿瘤血管正常化，这会增加T细胞浸润和增强肿瘤排斥反应，提高患者生存率［63］。嗜酸性粒细胞也表现出T细胞非依赖性的抗肿瘤免疫反应［65］。肿瘤来源的警报素IL-33介导了嗜酸性粒细胞在肿瘤内的迁移和激活，随后嗜酸性粒细胞脱颗粒释放出可以直接作用于肿瘤细胞的细胞毒颗粒，抑制肿瘤生长［66］。尽管肿瘤相关组织嗜酸性粒细胞增多利用双重制在一些实体瘤内介导了抗肿瘤活性，但肿瘤相关血液嗜酸性粒细胞增多却与乳腺癌、恶性血液病和骨髓增生异常综合征的预后不良相关［67］。 4.嗜碱性粒细胞 嗜碱性粒细胞起源于骨髓中的CMP细胞，成熟后被释放到循环中［2］。它们在循环白细胞中的比例不到1%，因此直到大约15年前，嗜碱性粒细胞都被认为在功能上与肥大细胞是重叠的［68］。在局部释放的细胞因子和趋化因子的作用下，嗜碱性粒细胞会迁移至过敏性炎症和受微生物攻击的部位［68］。由IgE介导的嗜碱性粒细胞活化可诱导多种炎症介质生成和快速释放，如组胺、白三烯C4、前列腺素以及大量的IL-4和IL-13［69］。嗜碱性粒细胞在刺激后的1小时内释放IL-4和IL-13，它们作为其他免疫细胞的化学诱导剂，使初始T细胞向Th2表型分化，以IgE依赖和IgE非依赖的方式产生Th2（过敏）型免疫反应［70，71］。此外，嗜碱性粒细胞表达的CD40配体与B细胞上的CD40结合，诱导B细胞向浆细胞转化并促进IgE抗体的产生［71］。 尽管嗜碱性粒细胞在肿瘤发生中的作用还不清楚，但研究者认为其可促进肿瘤血管生成［72］。嗜碱性粒细胞的胞浆囊泡中表达血管生成素1和血管生成素2信使RNA，可在细胞表面表达VEGFR-2和酪氨酸激酶1（Tie1）受体。另外，通过嗜碱性粒细胞和肥大细胞之间的相互作用，活化的嗜碱性粒细胞释放促血管生成因子VEGF-A和VEGF-B，可促进肿瘤血管生成。此外，在胰腺导管腺癌患者中，肿瘤引流淋巴结的嗜碱性粒细胞与Th2炎症相关，嗜碱性粒细胞的出现是术后生存不良的独立预后因素。以上均表明嗜碱性粒细胞在肿瘤发展和疾病复发中发挥了作用［73］。 1.1.2 肥大细胞 肥大细胞是造血系统来源的组织炎性细胞［74］，其起源一直存在争议。最近，Qi等［75］发现了前嗜碱性粒细胞和肥大细胞祖细胞（pre-BMPs）是一种粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMPs）群体，具有分化为嗜碱性粒细胞和肥大细胞的能力，同时保留有限的分化为骨髓细胞的能力。pre-BMPs在血液中循环并到达外周组织，分别在互斥转录因子C/EBPα和MITF作用下分化为嗜碱性粒细胞和肥大细胞［75］。嗜碱性粒细胞和肥大细胞有许多共同的特征，如表达IgE受体、存在相同的颗粒、受刺激时分泌类似的免疫反应介质和细胞因子。两者都能防御寄生虫感染，在Th2型免疫反应中发挥关键作用［76，77］。然而，肥大细胞基于其表型和细胞因子环境在组织化学、生物化学和功能特征方面表现出明显的差异，这种现象称为“肥大细胞异质性”［78］。肥大细胞可表达多种表面受体，包括KIT IgG受体和Toll样受体（TLRs）［78］。其典型特征是细胞质中存在密集的异染颗粒，颗粒含有组胺和肝素，与变应原接触后会爆发式地被释放出来［79］。除胃肠道和中枢神经系统外，组织肥大细胞是组胺的最大储存库，同时还含有一些预先形成的递质，如肝素、5-羟色胺、类胰蛋白酶和糜酶；脂质介质；细胞因子，如TNF-α/β、IFN-α/β、IL-1α/β、IL-5/-6/-13/-16和-18；趋化因子，如IL-8（CXCL8）、I-309（CCL1）、MCP-1（CCL2）、MIP-1αS（CCL3）、MIP1β（CCL4）、MCP-3（CCL7）、RANTES（CCL5）、嗜酸性粒细胞趋化因子（CCL11）和MCAF（MCP-1）；以及生长因子，如SCF、M-CSF、GM-CSF、bFGF、VEGF、NGF和PDGF［79］。这些因子通过IgE或IgG依赖性机制激活被合成并被迅速释放。肥大细胞在黏膜和组织环境表面之间界面的关键定位，例如靠近血管、神经、腺体和上皮表面下［76，78］，以及它们预先储存TNF-α的能力，使得肥大细胞能够对入侵的病原体作出第一反应［74］。不同的刺激会激活肥大细胞中的不同通路，导致肥大细胞释放不同的分子混合物，这对T细胞的分化和随后的获得性免疫反应有很大影响［74］。在许多肿瘤中发现肥大细胞数量增加可能对肿瘤发展具有双重作用。肥大细胞浸润与一些癌症如前列腺癌［80］、 唇癌［81］以及弥漫性大B细胞淋巴瘤的不良预后有关［82］。这可能是因为瘤内肥大细胞是促血管生成和刺激肿瘤生长介质的丰富来源，能刺激或调节血管生成；同时，瘤周肥大细胞含有丰富的类胰蛋白酶和糜酶，能促进细胞外基质降解和肿瘤侵袭，从而导致肿瘤进展［81，83，84］。与此相反，肥大细胞浸润与乳腺癌［85］、卵巢癌［86］、肺癌［87］和结直肠癌［88］的预后良好相关。这是因为基质肥大细胞释放了一些抗肿瘤因子，包括具有内源性细胞毒性的过氧化物酶、细胞因子（如IL-1、IL-4、IL-6和诱导内皮细胞凋亡的TNF-α）、抑制血管生成的糜酶以及导致肿瘤纤维化的类胰蛋白 酶［86，89，90］。因此，显而易见的是，由于肥大细胞能够调节免疫反应，因而肿瘤样本中肥大细胞的密度、位置以及肥大细胞与基质细胞之间的相互作用，可以预测患者生存［1］。 1.1.3 树突状细胞 树突状细胞是分布于身体大多数组织中的专职抗原提呈细胞，并在次级淋巴组织中富集［91］。在稳定状态下，它们起源于单核细胞和树突状细胞祖细胞（MDP），来源于骨髓中的CMP细胞［92］。 MDPs在骨髓中产生单核细胞和共同DC祖细胞（CDPs）［93］。CDPs分化出前DCs，它们从骨髓通过血液迁移到淋巴组织和非淋巴组织，并分化为经典的DCs（cDCs）。前DCs缺乏DCs的形态和功能，但在微生物或炎症的刺激下能发育为DCs［94］。浆细胞样DCs是一种存在于血液、胸腺、骨髓和次级淋巴组织中的前DCs，病毒入侵时它们产生Ⅰ型IFN-α。cDCs可大致分为迁移性DCs和淋巴组织驻留性DCs。迁移性DCs（朗格汉斯细胞和皮肤DCs）是存在于周围组织的未成熟DCs，在捕获抗原方面非常有效。它们使用包括TLRs和NOD样受体（NLRs）在内的多种受体对入侵病原体进行采样。当遇到病原体时，外周组织中具有吞噬作用的未成熟DCs短暂上调内吞作用，以促进大量抗原的累积［3］。由于抗原肽的形成较少［3］、MHCⅡ类分子在溶酶体中泛素化、共刺激配体（CD80，CD86）表达低下［3，95］等原因，未成熟DCs在细胞表面形成肽-MHC复合物的效率相对较低。此后不久，DCs功能成熟会触发抗原提呈机制，这是固有免疫和获得性免疫之间的关键环节［96］。由于DCs的内吞作用降低，以及可能的MHCⅡ类分子泛素化停止等，导致MHCⅠ、MHCⅡ和共刺激分子在表面的表达增加［95］。因此，成熟DCs降解病原体，并将细胞表面的MHCⅠ类或Ⅱ类分子上的抗原肽提呈给初始T细胞，同时表达共刺激配体（CD80、CD86），并迁移到淋巴组织的T细胞区［3］。配体与T细胞上的共刺激分子结合引发T细胞激活［95］。根据病原体的类型和接收到的其他成熟信号，活化的T细胞能够增殖并分化为细胞毒性效应T细胞或辅助性T细胞［3］。DCs也可以直接提呈完整的抗原，并激活抗原特异性B细胞［3］。淋巴组织内的DCs（CD8+和CD8-脾脏cDCs以及胸腺cDCs）是未成熟的DCs，仅位于初始T细胞被激活的区域［95］，它们将淋巴器官中的抗原提呈给T细胞［94］，可能负责在稳定状态下维持外周免疫耐受。在炎症条件下，一些DCs可能来源于CLP细胞和单核细胞［2］。例如，一种炎症性DCs能够产生肿瘤坏死因子和诱导一氧化氮合成酶（Tip DCs）［94］。 在正常情况下，DCs负责维持对宿主细胞的免疫耐受［3］。稳定状态下，DCs通常在表型和功能上都不成熟。不成熟状态的特点是MHCⅡ类分子的泛素化和细胞内积累以及低水平的共刺激分子［91］。因此，在没有感染的情况下，虽然DCs不断向T细胞提呈自身抗原和非致病性环境抗原，但这诱导产生的是Tregs而不是效应性T细胞。在癌症的发展过程中，肿瘤细胞与正常细胞更为相似。因此，在没有炎症的情况下，DCs更易诱导外周耐受。此外，免疫抑制的其他机制，如PD-L1和PD-L2的表达、TGF-β、IDO抑制DCs和T细胞的功能，也促进肿瘤细胞逃避免疫识别，也许这解释了为何疫苗没能成为一种有效治疗癌症的方式［3］。DCs被恰当地称为免疫系统守门人，因为其能够检查微环境、解析环境中的线索并指导免疫细胞在耐受性和免疫原性之间做出快速和适当的反应［91］。然而，DCs在TME中的募集受到肿瘤细胞内在因素的影响［97］。例如，WNT/β-catenin信号通路激活会阻止DCs的募集并抑制T细胞的激活，导致免疫排斥［98］。与此相反，肿瘤浸润的NK细胞招募并促进DCs在TME中的生存［99］。因此，DCs启动的抗肿瘤反应主要取决于TME中的免疫环境。 1.1.4 自然杀伤细胞 自然杀伤（NK）细胞是先天免疫系统中最强大的淋巴细胞，具有强力的细胞毒性。它们起源于骨髓中的CLP细胞，占循环中所有淋巴细胞的15%［1］。此外，它们还位于许多外周组织中。尽管NK细胞不表达抗原特异性表面受体，如B细胞的经典膜结合的Igs或T细胞的T细胞受体（TCR），但它们表达多种激活性和抑制性细胞表面受体。NK细胞的主要功能是识别和消除不能产生自身MHCⅠ类分子的细胞，在成熟过程中能通过表达一些细胞表面抑制性受体来识别“迷失的自我”，如与MHCⅠ类配体特异结合的杀伤细胞抑制性受体-L（KIR-L）［100］。在稳态条件下，常细胞组成性表达的同源MHCⅠ类配体与这些受体结合并通过转导抑制信号来确保自身耐受性［101］。但由于肿瘤细胞和病毒感染等导致细胞缺乏这些MHCⅠ类配体，使它们能被NK细胞识别和破坏［100］。 NK细胞的效应器功能是在细胞表面激活受体的参与下触发的，这些受体包括强效的NKG2D受体、杀伤细胞Ig样受体（KIR-S）、TLR和NLR，可通过识别病原体相关分子模式（PAMP）来识别非自身感染的细胞和应激状态的自身细胞［102］。然而，NK细胞的激活取决于其与辅助性细胞的相互作用，如DCs、中性粒细胞、巨噬细胞和肥大细胞和（或）细胞因子微环境，包括IL-2、IFN-α/β、IL-12、IL-15、IL-18或IL-21［103，104］。DCs是NK细胞的关键伙伴，位于NK细胞附近，通过直接接触或分泌细胞因子IFN-α、IL-2、IL-12、IL-15或IL-21来刺激NK细胞［105］。活化的NK细胞诱导细胞毒性和（或）促进细胞因子的产生［105］。NK细胞通过释放含有穿孔素和颗粒酶的胞浆颗粒或表达Fas配体（CD95）或TNF-α相关凋亡诱导配体（TRAIL）与肿瘤细胞上的死亡受体结合触发凋亡来杀死肿瘤细胞［106］。然而肿瘤细胞会进化并逃避NK细胞的破坏［106］。肿瘤细胞常见的逃逸机制是NKG2D配体的蛋白水解［107］。此外，通过肿瘤细胞表面TGF-β和NKG2D配体（包括MHCⅠ类同源物MICA和MICB）的肿瘤相关表达对NKG2D途径的慢性刺激，可以通过诱导内吞作用和破坏NK细胞上被激活的NKG2D受体来削弱NKG2D信号通路的功能［108，109］。这导致NK细胞上NKG2D的表达明显降低，从而促使T细胞沉默和肿瘤细胞逃避免疫监视。然而，NK细胞可通过其他机制（例如抗体依赖性细胞毒性）来攻击肿瘤细胞［110］。NK细胞能表达其他激活受体，例如能与Ig的Fc区结合的CD16和Fc-γ受体Ⅲa（FCGR3A）［111］，使其能够识别抗体包被的肿瘤细胞并通过释放穿孔素破坏它们。 根据CD56和CD16的表达与否，NK细胞可以分为至少两种功能亚群［112］。CD56dimCD16+ NK细胞占循环系统NK细胞的90%。这些细胞被一些趋化因子吸引到外周组织，表达穿孔素、天然细胞毒性受体（NCR）和KIRs。被激活后，CD56dimCD16+ NK细胞的细胞毒性更强并分泌低水平的细胞因子。另一方面，CD56brightCD16- NK细胞主要位于次级淋巴组织中，占循环中不到10%的NK细胞，它们缺乏穿孔素、NCR和KIRs。被IL-2激活后，CD56brightCD16- NK细胞产生细胞因子，主要是IFN-γ、GM-CSF和TNF-α。然而，在IL-2的长期刺激下，它们会表达穿孔素、NCR和KIRs并获得细胞毒性功能。 虽然NK细胞在传统上被认为是固有免疫细胞，但它们也表现出T细胞的特征，并且能够在再次接触时产生快速而强烈的免疫反应［113］。NK细胞的免疫记忆功能在初次接触后能持续数月，并具有抗原特异性，可以转移到未免疫动物身上［113］。尽管NK细胞是具有免疫记忆的强大杀伤细胞，但它们有限的浸润肿瘤的能力限制了其发挥抗肿瘤活性的作用，导致在临床方面只能体现出一定程度的疗效［114］。目前正在研究一些增强NK细胞活性的方法。近年来，NK细胞已经被设计表达具有功能性和细胞毒活性的TCR（TCR-NK-92）［115］。基于在临床前研究中证实了其具有抗肿瘤活性及无限扩增的能力，工程化的NK细胞正在难治/复发性急性髓系白血病和淋巴瘤患者中进行评估。来自脐带血的抗CD19嵌合抗原受体（CAR）-NK细胞在73%的复发或难治性CD19阳性肿瘤（非霍奇金淋巴瘤或慢性淋巴细胞白血病）患者中产生了客观缓解［116］。几项临床试验也正在评估NK细胞治疗实体肿瘤的疗效。 ?2?　获得性免疫系统 由T淋巴细胞（T细胞）和B淋巴细胞（B细胞）介导的获得性免疫的特点之一是对抗原刺激的免疫反应的特异性，另一个独特的特点是它能够赋予持久的免疫记忆，从而在以后接触相同的抗原时产生更快速和强大的免疫反应［2］。固有免疫反应由存在胚系编码的细胞表面受体而迅速启动。与此相反，获得性免疫反应是一个较慢的过程，因为淋巴细胞在激活后需要进行克隆性扩增，在效应细胞发展达到足够的数量才会产生免疫反应［30］。获得性免疫反应可分为体液、细胞介导的免疫反应两类。体液免疫反应是B淋巴细胞介导的，针对细胞外、血液和体液中的抗原。而细胞免疫反应是由T淋巴细胞介导的，能够识别细胞内病原体提呈在MHC分子上的小抗原决定簇。 2.1 获得性免疫系统的细胞成分 T淋巴细胞和B淋巴细胞起源于CLP，CLP是一种源自多能造血干细胞的特殊类型干细胞［2］。 2.1.1 T淋巴细胞 淋巴系祖细胞从骨髓迁移到胸腺，在胸腺经历四个阶段的分化和增殖，其中包括发育检查点，以确保不能识别抗原-MHC复合物或不能区分自我抗原的细胞无法成熟［117］。当淋巴系祖细胞通过皮质层迁移时，它们在与胸腺上皮细胞不断相互作用的基础上经历选择程序［118］。在皮质-髓质交界处进入胸腺的淋巴系祖细胞不表达TCR或CD4或CD8共受体，因此被称为CD4/CD8双阴性（DN）淋巴细胞（DN1）［119］。当它们通过皮质从皮质-髓质交界处移动到囊下区域时，淋巴系祖细胞失去了形成B细胞或NK细胞的能力，成为T细胞前体（DN2）［120］。在T谱系的作用和重组激活基因1（RAG1）的表达之后，TCRβ链被重新排列并与前Tα链配对，导致前TCRs（DN3）的表达［117］。随后，快速增殖产生许多胸腺细胞（DN4）。在细胞因子的适当刺激下，它们首先表达CD8共受体，然后表达CD4共受体，成为双阳性（DP）胸腺细胞。这伴随着TCRα链的重排，从而产生完整的αβTCRs。然后，DP胸腺细胞与TECs相互作用，进一步发展为初始T细胞，这一过程依赖于它们与MHCⅠ类或MHCⅡ类分子结合的能力（阳性选择）［117，121］。大约90%的DP胸腺细胞表达的TCR不能与MHC分子结合，致使这些细胞随后发生凋亡（因忽视而死亡）。基于它们与MHC分子的相互作用，DP胸腺细胞能通过沉默一个共受体位点的转录而分化成单阳性T细胞［118，122］。 在髓质中，T细胞被筛选出针对广泛的组织特异性蛋白的反应性，包括胸腺髓质上皮细胞表达的自身抗原肽［30］。表达TCR的T细胞对自身肽具有高亲和力，会迅速凋亡，随后被胸腺巨噬细胞清除（阴性选择）。表达中等水平TCR信号的T细胞通过阳性选择进入成熟阶段。若T细胞表达的TCR与MHCⅠ类分子结合，则成熟为单阳性的CD8成熟T细胞（CD8+T细胞）；若表达的TCR与MHCⅡ类分子结合，则成熟为单阳性的CD4成熟T细胞（CD4+T细胞）。然后这些初始T细胞在髓质环境中寻获抗原提呈树突状细胞。在接触到APCs呈现的抗原决定簇时，T细胞在APCs上的B7分子（CD80和CD86）共同刺激CD28的情况下被激活，形成效应T细胞，破坏致病因子或吸引其他免疫细胞到该部位。在髓质中没有被抗原刺激的情况下，初始T细胞进入血流，前往外周淋巴组织，并进入LN的皮质旁区域。在肿瘤引流的LN中，在MHC分子和同一APC上表达的B7蛋白（CD80或CD86）共同刺激T细胞表面组成性表达CD28的情况下，初始T细胞遇到肿瘤抗原而被激活［123］。这导致淋巴结中的初始T细胞进行克隆扩增并分化为效应T细胞（CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞）。根据细胞因子环境和TME中的转录因子特征，CD4+辅助T细胞分化为几个亚型，包括Th1［124］、辅助性T细胞2（Th2）［125］、辅助性T细胞17（Th17）［126］、诱导Tregs（iTregs）［127］、滤泡辅助性T细胞（Tfh）［128］和辅助性T细胞9（Th9）［129］。这些辅助T细胞分泌的细胞因子和趋化因子可调节免疫反应。Th1细胞通过激活CD8+T细胞来促进细胞介导的免疫，对细胞内病原体产生免疫反应；而Th2细胞则通过激活B细胞促进体液免疫，来对抗细胞外寄生虫。另一方面，由MHCⅠ类分子上的抗原提呈或通过CD4辅助T细胞激活的CD8+效应T细胞具有直接的细胞毒性。因此，它们迁移到肿瘤部位并摧毁肿瘤细胞。此外，一些被激活的T细胞和B细胞会分化成记忆细胞，负责持久的免疫记忆功能［130］。随后再暴露于相同的抗原会引起更快速和更强大的免疫反应。一小部分T细胞称为γ-δT细胞，表达由一个γ链和一个δ链组成的独特TCR，这些TCR由γ和δ基因位点编码。虽然这些细胞表达克隆重排基因，但它们表现出不依赖于MHC/人白细胞抗原（HLA）限制的抗肿瘤活性，后者是传统αβT细胞的一个基本特征。此外，它们也有许多与NK细胞相关的标志物。由于它们与固有和获得性免疫系统的共同特征，人们对开发基于γ-δT细胞的免疫治疗越来越感兴趣。 T细胞反应的调节是免疫检查点的共刺激性和抑制性信号之间的一种微妙平衡调控。在正常的生理条件下，这些T细胞受体的作用是维持免疫平衡和防止自身免疫。共刺激受体包括CD28、诱导性T细胞共刺激因子（ICOS）、4-1BB（CD-137）、OX40（CD-134）。CD40和糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白（GITR），而CTLA-4、程序性死亡受体1（PD-1）、淋巴细胞激活基因-3（Lag-3）、T细胞免疫球蛋白-3（Tim-3）和T细胞免疫球蛋白和ITIM域（TIGIT）是共抑制性的［132］。 CD28是在初始T细表面组成性表达的主要共刺激分子。当配体与APC上的B7-1和B7-2结合时，它们为T细胞的激活和下游信号的传递提供了重要的共刺激信号［133］。ICOS是CD28家族的另一个成员［134］。虽然在结构上与CD28和CTLA-4相似，但它不是组成性表达，而是在活化的CD4+和CD8+T细胞上诱导性表达。在与活化树突状细胞上表达的B7-H2的配体结合时，ICOS增强了T细胞的增殖。但与CD28不同的是，CD28会上调IL-2，而ICOS的刺激会上调IL-10的表达。此外，ICOS诱导T细胞的共同刺激可引发CD40配体的上调，并促进B细胞合成免疫球蛋白。 除了CD28和ICOS，还有其他属于TNF受体超家族的共信号受体，如4-1BB［135］、OX40［136］、CD40［137］和GITR［138］。这些受体与TCR信号协同作用，促进细胞因子的产生和T细胞的激活。4-1BB、OX40和GITR在活化的CD4+和CD8+T细胞及其配体在活化的APC上瞬时上调［139］。在配体结合时，共刺激信号增强了T细胞的扩增和细胞毒效应功能。然而，它对Tregs的影响取决于TME中的细胞因子环境。一般来说，T细胞激活受体的参与会影响初始T细胞向FoxP3+Tregs的转化，清除肿瘤浸润性Tregs，从而阻断Tregs的免疫抑制功能［140］。然而，在没有IFN-γ或IL-4的情况下，激活性受体的刺激会增强Tregs的增殖和累积。因此，共刺激受体的激活对Tregs有双重作用。CD40与TNF受体超家族的其他成员不同，它主要表达在APC和巨噬细胞上，而其配体CD40L则在活化的T细胞上短暂表达［139］。CD40的激活通过激活树突状细胞和促进巨噬细胞依赖性的肿瘤杀伤作用间接诱导肿瘤消退［141］。CD40激活还通过介导抗体依赖的细胞毒性、补体介导的细胞毒性和程序性细胞死亡表现出直接的细胞毒性作用。T细胞的刺激作用被一种抑制机制所抵消，以维持免疫平衡状态。活化的T细胞表面同时表达CTLA-4和PD-1作为免疫检查点［142-144］。CTLA-4是一种CD28同源物，与B7分子结合的亲和力更强，是一种在启动阶段调节T细胞活性的早期共抑制信号。在与B7接触时，CTLA-4阻断了CD28的共刺激，并消除了T细胞活性和细胞因子的产生。另一方面，CD28家族成员PD-1是一个晚期共抑制信号，在外周组织的效应阶段调节T细胞活性。PD-1与两个配体PD-L1和PD-L2相互作用。PD-L1在许多细胞上表达，包括肿瘤细胞和活化的B和T细胞，以应答活化的T细胞产生的IFN-γ，而PD-L2只在巨噬细胞和树突状细胞上表达［145］。与CTLA-4不同，PD-1与PD-L1配体的结合并不干扰共刺激，而是通过干扰TCR和BCR下游的信号通路来减少B细胞和T细胞的增殖以及细胞因子的产生［146］。除了CTLA-4和PD-1，还有其他新一代共抑制受体，如淋巴细胞激活基因-3（Lag-3）、T细胞免疫球蛋白-3（Tim-3）和T细胞免疫球蛋白和ITIM域（TIGIT），它们在不同的淋巴细胞亚群上表达，对免疫反应有不同的抑制作用［147］。例如，Tim-3途径可能调节肠道的免疫反应，而TIGIT可能调节肺部免疫反应，Lag-3调节胰腺免疫反应。同样，它们也表现出功能特异性，即TIGIT可以选择性抑制Th1和Th17细胞的促炎症反应，同时促进Th2细胞的反应［148］。除了免疫检查点，这种免疫抑制作用的主要贡献者是Tregs，这是一种特殊的T细胞，可抑制其他T细胞的细胞毒性功能［149］。它们被分为胸腺衍生的天然Tregs（nTregs）和外周衍生的可诱导Tregs（iTregs）。以表面表达CD4和CD25抗原和核表达叉头框蛋白P3（FOXP3）为特征的nTregs是阳性选择的胸腺细胞，对MHCⅡ类分子上的自身抗原具有相对较高的亲和力。相反，在TGF-β存在的情况下，iTregs在外周从初始CD4+T细胞中分化出来。它们通过表达免疫抑制性细胞因子如IL-10和TGF-β来发挥免疫抑制作用［127］。降低Tregs细胞的活性可以增强固有和获得性免疫反应，可用于治疗肿瘤［150］。因此，在正常情况下，免疫激活和抑制途径的协调调控，在维持外周耐受性和调节T细胞反应的幅度和持续时间方面起着重要作用［151］。 2.1.2 B淋巴细胞 B淋巴细胞在胎儿期由肝脏中的造血干细胞发育而来，在成年期持续存在于骨髓中［2］。由淋巴祖细胞、前祖B细胞、早期祖B细胞、晚期祖B细胞和前B细胞发育而来的四个B淋巴细胞前体亚群缺乏表面免疫球蛋白［152］。在重组激活基因1和2的存在下，这些细胞不断与骨髓基质细胞相互作用，为B细胞发育提供关键的生长因子、趋化因子和细胞因子。B细胞前体经历编码重链（H）基因的顺序重排［153］。DJ重排发生在早期祖B细胞中，随后是发生在晚期祖B细胞中的VDJ重排，形成细胞质中具有完整Igμ重链的大前B细胞［2］。μ重链与替代轻链（L）和两条不变的副链Igα和Igβ结合形成前B细胞受体（BCR），该受体在前B细胞表面瞬时表达，阳性选择这些细胞进一步发育。这会启动一个负反馈回路，通过该回路关闭重组激活基因的表达，停止前B细胞中的H基因重排，防止第二个H基因重排（等位基因排斥），并发出前B细胞增殖的信号。重组激活基因被重新表达，从而在阳性选择的前B细胞中诱导编码L的基因重排，从而形成未成熟B细胞，并在细胞表面表达完整的IgM BCR。这触发了L基因重排的停止。由于这个过程会形成大量能够识别多种抗原（包括自身抗原）的B细胞受体池，未成熟B细胞在离开骨髓前需要被检测对自身抗原的反应性。当未成熟的B细胞表达具有最佳下游信号的非自身反应性B细胞受体时，重组激活基因表达下调，这允许阳性选择这些细胞作为过渡性B细胞进入脾脏。相反，当未成熟B细胞表达非自身反应性BCR且只产生低水平的基线BCR信号时、以及当未成熟B细胞具有强烈的自身反应性时，它们会被阴性选择，通过凋亡（克隆清除）而被消除。或者，这些细胞可能被失活（失能）或可能经历受体编辑，后者是L基因二次重排导致形成非自身反应性新BCR的过程，这一过程使这些细胞随后能够通过阳性选择进一步发育［154］。 未成熟的B细胞以过渡细胞状态进入脾脏。因为大多数T1细胞对仅在外周组织中表达的自身抗原有强烈反应而经历克隆清除或失能，故很少有细胞从T1期进入T2期［155］。此外，细胞从T1期到T2期的转变还依赖于基础的滋养型BCR信号（tonic BCR signaling）。T2期细胞通过B细胞激活因子（BAFF）-R接收促生存信号，并分化为同时表达IgM和IgG表面受体的初始B细胞。在强烈的BCR信号指令下，初始B细胞分化为具有中等BCR信号并表达布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton tyrosine kinase，BTK）的滤泡（follicular，FO）B细胞或具有弱BCR信号并表达NOTCH同源物2（NOTCH2）的边缘区（marginal zone，MZ）B细胞［155，156］。位于脾白髓内的边缘区B细胞是不参与循环的静息成熟B细胞。它们的抗原特异性有限，可被非蛋白抗原激活，如不依赖T细胞的常见血