病原生物学与免疫学实验（第2版）

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第一篇实验室生物安全知识
　　第一章实验室生物安全概论
　　一、生物安全的概念
　　生物安全是指生物性的传染媒介通过直接感染或间接破坏环境而导致对人类、动物或植物的真实或潜在危险。
　　二、生物安全等级
　　生物安全等级（biosafety level），根据生物因子对个体和群体的危害程度将其分为四级：
　　（一）风险等级Ⅰ（低个体危害，低群体危害）
　　不会导致健康工作者和动物致病的细菌、真菌和寄生虫等生物因子。
　　（二）风险等级Ⅱ（中等个体危害，有限群体危害）
　　病原体能引起人或动物发病，但一般情况下对健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危害。实验室感染不导致严重疾病，人类对病原体感染具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限。
　　（三）风险等级Ⅲ（高个体危害，低群体危害）
　　病原体能引起人类或动物的严重疾病，或造成严重经济损失，但通常不因偶然接触而在个体间传播，并且人类对其感染具备有效治疗和预防措施，如能使用抗生素、抗寄生虫药治疗。
　　（四）风险等级Ⅳ（高个体危害，高群体危害）
　　病原体能引起人类或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容易直接或间接传播，或因偶然接触在人与人、动物与人、人与动物或动物与动物间传播，人类对其感染一般没有有效治疗和预防措施。
　　三、生物安全实验室的概述
　　生物安全实验室（biosafety laboratory），也称生物安全防护实验室（biosafety containment for laboratory），是通过防护屏障和管理措施，能够避免或控制被操作的有害生物因子危害，达到生物安全要求的生物实验室和动物实验室。
　　（一）生物安全实验室的分级
　　依据实验室所处理对象的生物危险程度，把生物安全实验室分为四级，其中一级实验室对生物安全隔离的要求最低，四级实验室要求最高。生物安全实验室的分级见表 1-1-1。
　　表 1-1-1 生物安全实验室的分级
　　（二）生物安全实验室的表示
　　以 BSL（biosafety level，BSL）-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表示仅从事体外操作的实验室的相应生物安全防护水平。
　　（三）生物安全实验室的分类
　　根据实验活动的差异、采用的个体防护装备和基础隔离设施的不同，生物安全实验室可分为：
　　1.通常认为不经空气传播致病性生物因子的实验室。
　　2.可有效利用安全隔离装置如生物安全柜来操作常规量经空气传播致病性生物因子的实验室。
　　3.利用具有生命支持系统的正压服来操作常规量经空气传播致病性生物因子的实验室。
　　（四）生物安全实验室的危险标识
　　生物安全实验室所在的实验室入口及核心工作间均应粘贴标有生物危害的国际通用标识（图 1-1-1），非工作人员未经允许不得入内。
　　图 1-1-1 生物安全实验室危险标识
　　第二章 生物安全实验室的主要设备及操作
　　一、生物安全柜
　　（一）定义
　　生物安全柜（ biological safety cabinet，BSC）是为操作具有感染性的实验材料如原代培养物、菌（毒）株及诊断性标本时，用来保护操作者、实验室环境及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的具有过滤作用的负压排风装置（注意：超净工作台不属于生物安全柜，不能应用于生物安全操作）。
　　（二）防护原理
　　生物安全柜排风系统的海帕（ high efficiency particle air，HEPA）过滤器对直径为 0.3μm的颗粒截留效率为 99.97%，对更大或更小颗粒的截留效率为 99.99%，确保排出的是完全不含有微生物的空气，从而保护环境；进入生物安全柜内的空气送至工作台面前经 HEPA过滤器在柜内形成百级洁净度的环境，从而保护了样品；经生物安全柜前窗口进入的空气与柜内下送风在前窗口共同形成气幕，从而保护了操作者本人与操作对象不被交叉污染。
　　（三）生物安全柜的分级及功能
　　生物安全柜分为Ⅰ级（ BSL-1）、Ⅱ级（ BSL-2）和Ⅲ级（ BSL-3）生物安全柜； BSL-2级生物安全柜又分为 A型、B型、B2型、B3型。
　　生物安全柜的功能： BSL-1级生物安全柜可提供对人员和环境的保护，但不提供对样本的保护，常被用作特殊的密封设备（如离心），或被用于可能产生气溶胶的操作过程。 BSL-2级生物安全柜可提供对人员、环境和样本的保护，其中 B2型为全排风式生物安全柜，没有空气在安全柜内循环，可同时提供基本的生物和化学防护。 BSL-3级生物安全柜可提供对人员、环境和样本的最大保护，用于操作四级生物安全水平的微生物或病原体。
　　（四）生物安全柜的操作程序
　　1.生物安全柜在使用之前，应用紫外灯照射至少 30min，打开生物安全柜机至少 15min。
　　2.关闭紫外灯，打开日光灯，准备实验。
　　3.打开生物安全柜的门，其高度不能超过最高警戒线。
　　4.进入生物安全柜的 EP管，Tip头必须要经高压灭菌处理，其他未经高压灭菌处理的物品进入生物安全柜前必须用 70%乙醇消毒表面。
　　5.进入生物安全柜的物品，不应放置于通风口上面或外侧，而应放置于通风孔以里、台面上。
　　6.污物处理桶表面用 70%乙醇消毒后，加入大约 1/5体积的 0.5%次氯酸钠消毒液，并放置于生物安全柜内，实验中使用的 EP管、Tip头等物品一律放入污物处理桶中。生物安全柜内污物和洁净物应分开放置。
　　7.实验操作应严格按照无菌操作规范进行。
　　8.实验中溅出的血滴、血清等污物用 0.5%次氯酸钠消毒液和 70%乙醇进行消毒处理。
　　9.实验结束后，对移出生物安全柜的物品应使用 70%乙醇消毒其表面。污物处理桶应进行高压灭菌处理后弃掉。
　　10.对安全柜的台面、边缘、后壁和观察窗内侧进行擦拭、消毒。首先使用 0.5%次氯酸钠消毒液处理 30s，擦去；后用 70%乙醇处理， 30s后擦去。
　　11.工作结束 5min后关闭生物安全柜机、日光灯。
　　12.工作人员离开实验室应摘下手套、脱下工作服并进行洗手。
　　13. 在生物安全柜使用记录本上进行登记。
　　二、洗眼装置
　　根据《实验室生物安全通用要求》（ GB19489—2008）的规定，应在实验室工作区配备洗眼装置。洗眼装置应安装在室内明显和易取的地方，并保持洗眼水管的通畅，便于工作人员紧急时使用。工作人员应掌握洗眼装置的操作方法。当在实验工作中遵循了所有应注意的事项以后，如发生腐蚀性液体或生物危害液体喷溅至工作人员的眼睛时，工作人员应该（或在同事的帮助下）在就近的洗眼台用大量缓流清水冲洗眼睛表面至少15～30min。
　　第三章实验室规则
　　1. 实验前要做好预习，掌握与实验相关的医学免疫学、医学微生物学及人体寄生虫学基础理论，明确实验目的与实验内容。进实验室只带必要的文具、讲义，并穿工作服。
　　2. 实验室内应保持清洁、安静，实验时要认真严肃，禁止抽烟、饮食和开玩笑。
　　3. 爱护实验器材，注意节约实验材料。不可擅自搬动示教实验器材或室内设施，如有损坏，应立即向指导教师报告，主动在破损物品登记本上登记。
　　4. 注意安全，酒精灯不可互相点燃，以防发生意外。
　　5. 医学微生物学实验要无菌操作，防止标本及纯培养物被污染，同时要避免病原微生物感染人体或污染环境。若带菌材料污染桌面、地板、书籍和衣物或误吸入口，应立即报告指导教师进行处理。实验中待培养的材料应放在培养区；实验用过的带菌材料如吸管、玻片等应放在指定的地方或消毒缸、消毒箱等消毒区，不得放在桌上或冲洗于水槽内。
　　6. 实验完毕，桌面应整理清洁，显微镜、接种环、染色液、试管架等物品放回原处。洗手后方可离室。
　　7. 实验室内任何物品（特别是菌种）不得带出室外。
　　8. 值日同学负责湿性打扫实验室，并关好水、电、门窗。
　　（朱苹）
　　第二篇医学免疫学实验
　　第一章医学免疫学基础实验
　　实验一中性粒细胞吞噬功能的测定
　　吞噬细胞主要包括单核吞噬细胞系统和中性粒细胞两大类。血液中的中性粒细胞为小吞噬细胞，通过趋化、调理、吞入和杀菌等步骤，能吞噬和消化衰老、死亡细胞及病原微生物等异物，是机体天然免疫力的重要组成部分。测定中性粒细胞的吞噬功能对了解机体的免疫功能状态具有重要意义。一般将患者治疗前后白细胞吞噬指数与吞噬百分比的动态变化，作为疗效观察和预后判断的参考指标。
　　【目的要求】观察小吞噬细胞的吞噬现象，加深对吞噬细胞吞噬功能的理解。
　　【实验材料】
　　1. 器材无菌三棱针、微量移液器、小试管、玻片、油镜、水浴箱等。
　　2. 试剂
　　（1）加热杀死的白葡萄球菌悬液（ 1×1010/mL）。
　　（2）安尔碘皮肤消毒液。
　　（3）肝素溶液。
　　（4）瑞氏染液。
　　【实验方法】
　　1.左手无名指用安尔碘皮肤消毒液消毒，随后用无菌三棱针采血 0.2mL，加入肝素溶液抗凝管中（含肝素 10U），摇刀。
　　2.于上述管中加入 0.1mL白葡萄球菌悬液，混刀，置于 37℃水浴箱中 30min，每 10min轻摇 1次。
　　3.取出后略加振摇，制作推片，干燥后做瑞氏染色。
　　4.油镜下观察，结果见目录中二维码内彩图 2-1-1。随机计数 100个中性粒细胞，分别记录发生吞噬和未吞噬的白细胞数，同时记录所吞噬的细菌数。结果可以用吞噬细胞百分比或吞噬指数表示。
　　吞噬细胞百分比：即 100个中性粒细胞中吞噬有细菌的中性粒细胞所占的比例。
　　吞噬指数：将100个中性粒细胞所吞噬的细菌总数除以 100，得到每个中性粒细胞吞噬细菌的平均数。
　　（吴林青）