食源肽改善皮肤光老化的途径与机制/博士后文库

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第1章 绪论
　　1.1 皮肤组织光老化进程中的渐进性多尺度变化
　　1.1.1 胞外基质组分代谢失衡是皮肤光老化的物质诱因
　　皮肤老化是指皮肤屏障功能衰老性损伤，表现出颜色、色泽、形态、质感等外观整体状况的改变，根据诱因可分为内源性老化和外源性老化。内源性老化是随年龄增长的自然老化，表现为皮肤变白，出现细小皱纹、弹性下降、皮肤松弛等。外源性老化的最主要原因是日晒所致的光老化，表现为皱纹、皮肤松弛、粗糙、淡黄或灰黄色的皮肤变色、毛细血管扩张、色斑形成等[1]。光老化是皮肤各种损美性的主要诱因，是现代皮肤科学的研究热点。
　　皮肤光老化反映在细胞水平即为细胞衰老，细胞活力的变化必然引起细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分发生关联性变化。多项研究表明，胶原蛋白、弹性蛋白及透明质酸(hyaluronic acid，HA)是皮肤真皮层中成纤维细胞的主要代谢产物[1～3]。长期日光照射可诱导皮肤组织多种细胞成分的改变，在ECM化学组成上表现为皮肤胶原蛋白、弹性蛋白与透明质酸的生物合成显著下降且生物降解加速，造成ECM结构性组分代谢失衡[4， 5]。
　　皮肤组织中ECM组分含量是皮肤衰老的重要指标。皮肤蛋白由大约75%的胶原蛋白组成，胶原蛋白维持着皮肤的弹性和水润状态[4， 6]，皮肤中胶原蛋白有多种类型，其中与弹性相关的主要为Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ，Col Ⅰ)和Ⅲ型胶原蛋白(Col Ⅲ)，在皮肤衰老进程中，Col Ⅰ含量下降而Col Ⅲ含量上升，调整二者比例则在一定程度上起到抗衰老效果。同时，羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)是胶原蛋白特有的一种非必需氨基酸，其含量相对恒定，约占胶原蛋白总量的13%，因此羟脯氨酸含量的增减可直接反映真皮组织内胶原纤维的沉积状况，从而可作为判定皮肤衰老程度的一个敏感指标[2， 8]。此外，透明质酸不仅对保持皮肤水分、维持皮肤结构起重要作用，而且具有促进皮肤再生、增强皮肤弹性、降解皮肤组织中自由基的功能[9， 10]。
　　调整光诱导的ECM代谢失衡是改善皮肤光老化的物质基础。长期日光照射可影响皮肤多种细胞成分改变，药理学预防皮肤老化的主要目标是保持真皮内弹性纤维正常。弹性蛋白生物合成急剧下降是皮肤老化的直接原因，刺激弹性蛋白基因表达的物质在改善皮肤老化上是有益的，如目前药用化妆品中功效成分维A酸是细胞增殖、分化和基因表达的强有力的生物调节剂，对真皮和表皮生长有着良好的促进作用[11]。Lee等[12]定量研究了弹性蛋白沉积量与皱纹量之间的相关性，结果表明基底膜处的耐酸纤维长度、宽度、数量和总面积与皱纹累积量存在显著的相关性，局部涂抹0.025%维A酸可促进慢性光损伤皮肤弹性纤维的修复。因此，胞外基质组分代谢失衡是皮肤光老化的物质诱因，修复受损的细胞外结缔组织是改善皮肤光老化的重要途径。
　　1.1.2 组织结构损伤是皮肤力学性能下降的病理基础
　　皮肤屏障功能的维持源于皮肤组织结构的完整，ECM退行性结构劣变是皮肤皱纹形成的力学基础。皮肤力学性质取决于细胞外结缔组织胶原蛋白、弹性蛋白和透明质酸三部分的含量及网络结构[1， 3， 13， 14]。皮肤组织在解剖学层面上具有清晰的表皮层、真皮层和皮下组织三层立体结构，每一层均由不同功能的细胞群体组成。正常生理状态下的皮肤组织表皮层和真皮层组织结构清晰、层次分明、排列有序，而老化皮肤其组织学特征为表皮不规则增生、真皮层萎缩、表皮和真皮连接处基底膜结构受损，乳头层扁平化，皮脂腺不规则增生，同时ECM规律性横纹排列消失，胶原蛋白碎片化，呈浓缩聚焦，而弹性蛋白则呈变性堆积[12， 15～18]。因此，通过物理或化学途径调整ECM代谢，修复受损ECM空间结构，增强皮肤力学性能是目前各种外用型抗皱护肤品的共同原理。
　　1.1.3 ECM结构降解酶系活力增强是形成皮肤皱纹的生化基础
　　ECM组分和结构是维持皮肤弹性特征的物质和力学基础，内源性或外源性刺激因子会上调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、弹性蛋白酶和透明质酸酶表达，使弹性纤维结构重组，形成细密或粗糙样皱纹[19]。目前，在ECM代谢相关酶的活性变化方面发现ECM降解酶系MMPs活力增强，已知紫外线(UV)照射与MMPs表达及皮肤光老化存在密切联系[1， 3， 19， 20]。MMPs的产生影响胶原纤维合成，使得真皮层内胶原纤维明显减少，排列稀疏紊乱。在MMPs家族中，MMP-1是ECM降解的关键酶，可将大分子胶原蛋白降解成片段化，然后片段化胶原蛋白进一步浓缩聚集，失去弹性结构，MMP-1活力高低与皮肤衰老状态呈正相关[2]。Naru等[20]以体外培养真皮成纤维细胞作为光老化模型，研究发现长波紫外线(UVA)照射正常成纤维细胞后MMP-1 mRNA的表达水平与照射强度呈正相关。MMP-1可作为评估皮肤光老化，特别是真皮成纤维细胞光损伤的一个特异性指标，其含量升高是介导胶原纤维结构劣变的关键步骤。Takeuchi等[21]研究发现慢性紫外线辐射可致HR-1裸鼠背部皮肤发生中性粒细胞浸润，并激活弹性蛋白酶表达降解ECM弹性蛋白，形成皱纹。因此，围绕ECM降解酶系中关键酶活力变化可在一定程度上揭示皮肤光老化及其干预措施的生化基础。
　　1.1.4 自由基触发的氧化与免疫应激调节失衡是介导皮肤光老化的生理基础
　　皮肤光老化的发生发展受多因素协同作用，其确切机制尚不明确，目前较公认的是活性氧(reactive oxygen species，ROS)自由基“呼吸”爆发和免疫抑制学说[1～3， 23]。ROS是正常有氧代谢的副产物，但在长期紫外线照射后，ROS会大量累积。ROS化学性质活泼，直接损伤生物膜、蛋白质和核酸等细胞代谢功能性大分子，使细胞磷脂分子中不饱和脂肪酸氧化生成过氧化脂质丙二醛(malondialdehyde，MDA)，MDA是慢性光老化产物之一，可反映细胞受氧自由基损伤的程度。同时多项研究表明，细胞氧化状态与细胞抗氧化酶活力密切相关，细胞抗氧化酶活力水平较高时可将代谢产生的过量ROS及时清除，维持细胞氧化和抗氧化状态平衡。人体皮肤具有对抗ROS的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)等抗氧化酶防御系统，当皮肤发生老化时，皮肤组织中氧化与抗氧化失衡。因此，基于ROS在光老化发生发展中的重要作用，寻找稳定有效的抗氧化剂，调节皮肤抗氧化防御体系表达水平，清除过量ROS是预防和治疗皮肤老化的重要手段，目前有许多研究证明口服或外用一些抗氧化剂可修复人体皮肤组织的抗氧化系统，对皮肤的老化起着预防和治疗作用[24， 25]。
　　同时多项研究表明，正常生理状态下，细胞炎性因子水平和抗炎因子水平基本处于平衡状态，抗炎细胞因子在对抗免疫抑制、调节免疫平衡方面至关重要。皮肤光老化不仅直接产生ROS损伤细胞，而且可改变白细胞介素(interleukin，IL)水平，增强IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎细胞因子表达，同时抑制抗炎细胞因子IL-2、IL-4、IL-10及TGF-β表达，使细胞因子调控网络失衡，从而引起细胞炎症反应[17]。UV辐射形成的ROS刺激角质形成细胞增殖活性提高并释放IL-6，间接促进UVA辐照后成纤维细胞表达MMP-1，从而不断分解真皮中的胶原蛋白，或造成胶原蛋白纤维束构造的紊乱，导致皮肤失去弹性并形成皱纹[2， 26]。因此，通过内源和外源途径消除过多的ROS、提高细胞抗氧化能力、降低细胞炎症因子水平、增强抗炎因子表达水平，回调自由基触发的氧化与免疫应激调节失衡是改善皮肤光老化的生理基础。
　　1.1.5 TGF-β在皮肤修复中具有重要意义
　　随着对光老化发生机制的深入研究，研究者发现细胞因子对皮肤光老化起着重要的介导作用，细胞因子在光老化中的作用越来越受到重视，ECM生长因子调控体系紊乱是皮肤皱纹形成的分子基础[4]。在众多细胞因子中，转化生长因子-β (transforming growth factor-β，TGF-β)是一种具有多种生物学效应的细胞因子，可介导多种信号通路将信号自细胞外传递至细胞核，调控基因转录，发挥相应的生物学效应[3， 27]。正常生理情况下，TGF-β处于一种动态平衡，维持组织内环境的相对稳定，长期UV应激使皮肤组织中TGF-β和TGF-β受体(TGF-βR)表达下调，成纤维细胞数目减少，并通过激活转录因子活性蛋白-1(active proteins-1，AP-1)阻断TGF-β/Smad信号通路，引起MMPs、组织蛋白酶、丝氨酸蛋白酶类、成纤维细胞弹性蛋白酶等ECM降解酶系的活性增加，直接导致胶原纤维和弹性纤维降解增加，从而导致表皮内陷引起深度皱纹。孔亚男[27]探讨TGF-β对UVA照射皮肤成纤维细胞的保护作用，结果表明成纤维细胞活力及胶原蛋白表达量均随辐照剂量的增加而显著下降，添加TGF-β处理可呈剂量依赖性提升细胞活力及胶原蛋白表达量，证明TGF-β对光老化有一定的干预作用，提示TGF-β在皮肤光老化修复中具有重要意义。
　　1.1.6 MAPK信号通路激活在介导皮肤光老化中起重要作用
　　丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)级联反应是调节正常细胞增殖、分化、存活和修复的关键信号通路，MAPK级联通路的紊乱常导致肿瘤及其他疾病。目前，UV诱导MAPK信号通路激活在皮肤光老化进程中起重要作用，其中p38 MAPK信号通路与UV诱导的细胞应激反应关系密切。UV通过MAPK信号通路激活核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)，同时诱导c-Jun表达上调，c-Jun与构成型c-Fos结合，形成AP-1，AP-1和NF-κB均可激活MMPs和细胞因子表达，从而损害真皮ECM，引发皮肤光老化损伤[3， 19， 28]。刘垠[29]采用UV照射体外培养的皮肤成纤维细胞，观察细胞形态变化及相关细胞因子变化，检测MAPK信号传导下游基因c-jun与c-fos表达变化，表明成纤维细胞c-jun mRNA表达随照射剂量累积而增加，与对照组比较有显著差异，其终末基因MMP-1/3表达也随照射剂量增加而显著增加，而c-jun基因沉默后MMP-1/3表达下调，证明c-jun基因对皮肤光老化中MMPs及胶原代谢存在显著影响。转录激活蛋白AP-1存在于许多细胞中，并与细胞的分化、增生、凋亡及肿瘤转化密切相关。核转录因子c-Jun是AP-1的组成部分，而AP-1是MMP-1基因表达所必需的，AP-1基因可被UV激活的信号通路活化。皮肤光老化中MMP-1与c-Jun密切相关，c-Jun表达上调，其信号下游的MMP-1表达也会随之升高，抑制c-Jun表达，MMP-1也会受到抑制。同时，MAPK信号通路中的细胞外信号调节激酶(extracellular singnal regulated kinase，ERK)通路在调控成纤维化细胞增殖及胶原沉积中发挥重要作用[2， 3]。以上结果提示特异性抑制MAPK信号通路很可能是皮肤光老化干预的有效靶标。
　　1.2 UV暴露可不同程度损伤消化系统形态结构与功能
　　1.2.1 UV暴露对动物消化系统有不同程度的损伤效应
　　器官形态是器官功能的直观反映，通过形态变化可初步评价器官功能，动物的脏器质量和脏器指数是主要生物学特性指标之一，免疫器官指数大小在一定程度上可反映机体免疫功能的强弱。脾脏是机体重要的免疫器官，脾是发生免疫应答的重要基地，是全身最大的抗体产生器官，对调节血清抗体水平至关重要。肝脏是腹腔内最大的实质性器官，担负机体重要生理功能，是异