植物生物技术综合实验

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综合实验一 突变体的遗传分析及基因定位
　　一、综合实验目的
　　本综合实验以基因克隆的原理与方法为依据，设计 7个分实验，实验彼此联系并且呼应。从拟南芥的种植与杂交开始，依次完成表型、基因型数据的获取，从而最终定位到突变基因在染色体上的位置。这一综合性实验可以帮助学生掌握表型测定、DNA提取、PCR和 PAGE凝胶电泳、数量性状基因座（QTL）作图的原理和方法。同时，也可以让学生从一个整体的角度审视这一综合实验，清楚每个实验间的联系和实验目的，从而培养学生的全局观。
　　二、综合实验原理
　　1．基因定位的基本原理
　　基因定位是指利用标记技术将基因定位在某一特定的染色体上，确定基因在染色体上线性排列的顺序和位置。利用未知基因与已知标记基因之间的连锁率 /交换率，将未知基因定位在特定染色体的目标区间内，位于两个尽量近的标记基因之间。
　　2．BSA法的基本原理
　　分离体分组混合分析法又称混合分组分析法（bulked segregant analysis，BSA法），首先从一对携带目标基因且具有表型差异的亲本所产生的分离群体中，根据目标基因的表型分别选取一定数量的植株，构成两个亚群或集团。将每个亚群的 DNA等量混合，形成两个相对性状的“基因池”（gene pool），然后用合适的分子标记对两个基因池进行分析，获得与目标性状基因座位连锁的多态性分子标记。在获得了与目标基因相连锁的分子标记以后，可以利用某一作图群体进行分析以便进一步检测所得分子标记与目标性状基因的连锁程度，以及其在某已知分子图谱中或染色体上的位置，这样才能完成真正意义上对基因的标记定位，如下图所示。由于建池时使用了特定的分离群体，并且在分组时仅对目标性状进行选择，这样可以保证其他性状的遗传背景基本相同，两个基因池之间理论上主要在目标基因区段存在差异，因此两基因池又被称为近等基因池，这就排除了环境及人为因素的影响，使研究结果更为准确、可靠。 BSA法克服了很多作物难以得到近等基因系的困难，并且比近等基因系法省时、省力，是一种非常实用的基因标记定位的方法，应用非常广泛。
　　三、综合实验设计
　　实验设计如左图所示。
　　实验一　拟南芥种植、生长发育及杂交
　　一、实验目的
　　1．了解拟南芥生长发育的基本条件和基本生物学特征。
　　2．通过学习控制光、温等条件来培养模式植物拟南芥。
　　3．掌握拟南芥的种植方法及杂交的过程与方法。
　　二、实验原理
　　拟南芥（ Arabidopsis thaliana）属被子植物门双子叶植物纲十字花科植物，拟南芥基因组大约有 12 500万碱基对和 5对染色体。拟南芥的优点是植株小、结子多，为自花授粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型植株。因此，拟南芥是进行遗传学研究的好材料，被科学家誉为“植物中的果蝇”。
1．　　播种和发芽
　　将播有种子的容器移至相应低温条件下，在 2～4℃下放置 2～4 d，从而在吸胀条件下破除种子休眠，这对新鲜收获的拟南芥种子来说尤为必要。大多数拟南芥品系的种子是中度休眠的，收获已久的这类生态型的拟南芥种子可免于低温处理，而有些生态型甚至需长达7 d 的低温处理。干种子的低温处理往往是无效的。低温处理后，将容器移至温室或生长室，在22℃左右培养发芽，夜温可比日温低2℃，用2000 lx 的荧光灯给予光照，光周期为8 h 光/6 h 暗（也可24 h 光照），在5 d 左右可见拟南芥发芽。拟南芥发芽需光，故应防止种子被土覆盖。
　　2．生长发育条件的控制
　　拟南芥一般是冬性一年生植物，自然条件下种子在秋天发芽，幼年期在冬天度过，花分生组织在春季分化，种子在夏季成熟脱落。大多数实验室栽植的拟南芥品种在发芽4 周后开花，而在开花后4～6 周内采集种子。不同生态型拟南芥的发育进程、开花时间、成熟时间等除了取决于遗传性以外，也受外界环境条件的影响。
　　1）光
　　光对拟南芥生长的影响涉及光强度和光周期两个方面。从光强度方面来说，在生长室中一般最适合的光强度为120～150 μmol/（m2 s），这可通过荧光灯配以白炽光来达到。在夏天温室中，60% 遮阴有助于光强控制和温度调节，较老植株可以忍受高光强或直接太阳光照射，而年幼植株则应避免强光。
　　拟南芥在连续照光和长日照下开花速度加快，短日照时开花过程被阻遏或延迟，这表明拟南芥开花需要长日照，光周期一般为12 h 光/12 h 暗。冬季在温室中可补充早晚的光照，以满足光周期需要，一般以16 h 光照、8 h 暗期为宜。连续光照可促进生殖生长，略微提早开花，但使叶数减少及种子生成量降低，而较短日照有利于营养生长。
　　2）温度
　　拟南芥的最适生长温度为25℃，稍低的温度也是允许的。当水分供应充足时，植物甚至能在温度高达34℃时生长，但会减少受精。虽然较老的植株能忍受高温，但保持25℃对整个植株生长周期是有利的。当种子形成时，生长室温度宜设定在25℃，夜温比日温低2～4℃为宜。
　　对于许多迟开花的拟南芥生态型来说，幼苗期要在4℃左右处理一个时期（如几周），以完成春化作用，从而在长日照下促进开花。而对于常用的拟南芥生态型，如Landsberg erecta（Ler）和Columbia 则不需春化处理就能开花。必须注意这里的低温春化处理不同于播种时破除休眠的低温处理，破除休眠的低温处理又称层积处理（stratification）。
　　3）水分
　　在种子发芽后的头几周里，理想的供水是来自土壤毛细管由下至上的渗水，只有当土壤呈现干旱时才适时灌水。过量供水会引起土表藻类和真菌的生长。在拟南芥头两片真叶开始伸展之前必须避免干旱，当真叶长出后，灌水频率可相应减少，如每周一或两次。而在角果充实阶段必须保证水分供应，以利于种子形成。在角果成熟阶段浇水时最好待90% 左右的穴盘或花盆干燥之后进行。土壤供水状况会影响拟南芥的生长发育。湿度的增加（如 50%～60%）会大大减少土表干旱的影响以及发芽幼苗脱水的危害，但一般来说，拟南芥植株包括幼苗都能忍受低湿度。处在莲座状阶段的植株可在不同湿度下生长，当长角果进入成熟阶段时，较低湿度（如＜50%）是有利的。
　　4）营养
　　正常情况下无须供给营养物质，但是贫瘠的营养状况会降低植株高度，使它提早开花，并使种子着生减少。在生长发育的后期阶段补充营养物质会促进种子着生，并产生较健壮的植株。当植株呈现出轻微淡绿色时，表明营养供给不足，应立即施以营养物质，正常健壮的拟南芥植株是亮暗绿色的。
　　5）防止杂交
　　拟南芥是自花授粉植物，为了保持拟南芥品系的纯化，必须防止温室或生长室中各品系之间的杂交。为此可根据各自实验室条件进行设置，如保持生长环境的清洁，从而切断经昆虫媒介而导致的杂交途径。栽植时注意各品系之间的种植距离（如 20 cm），从而防止不同品系的花互相接触。在长成植株后，可采取适当措施，防止植株倒伏，避免互相接触。
　　因此，人为恰当地调节光照和温度等条件是很好地控制拟南芥生长发育的关键。低温和长日照都有利于拟南芥的开花。如果希望拟南芥具有良好的营养体，则可通过适当缩短光照时间来实现；如果想使拟南芥的生育期提前，可以通过适当密植或延长光照时间来实现。
　　三、材料与用品
　　1．实验材料
　　Ler生态型拟南芥种子（野生型）、rrg短根突变型拟南芥种子（突变型）。
　　2．实验器具
　　小滤纸条、镊子、蛭石、田园土、一次性塑料杯子、杂交袋、托盘、光照培养箱等。
　　四、实验步骤
　　1．拟南芥的种植
　　（1）将蛭石和田园土按 1∶1混合，装入底部戳 4或 5个小孔的一次性塑料杯子内。
　　（2）将上述准备的盛有混合土的杯子放到托盘中。
　　（3）取小滤纸条对折并撮少许 Ler生态型拟南芥种子和 rrg短根突变型拟南芥种子，然后均匀地撒在沙土的表面，每种种子各自种一杯。
　　（4）待所有的种子都播种完成之后，用自来水浇灌直到一次性杯子内沙土的上表面完全被水浸湿为止。
　　（5）将播种并浇灌完成的一次性杯子连同托盘一起放到光照培养箱内，培养箱的温度设置为22℃，光照时间为每天12 h。
　　（6）适时浇水、观察（图1-1）。
　　图1-1　拟南芥的生育期
　　A．1 周2 片真叶幼苗；B．2 周4 片真叶幼苗；C．3 周8 片真叶幼苗；D．4 周抽薹前期幼苗；E．5 周抽薹期成株；F．盛花期成株；G．花；H．花絮；I．种子
　　2．拟南芥的有性杂交
　　（1）选择母本：选择刚刚能看见一点白色花苞的拟南芥作为母本。
　　（2）去雄：用消毒好的镊子小心去掉母本花的花萼（绿色部分），随后去掉花瓣（白色部分），最后去掉雄蕊（呈微黄色）。
　　（3）选择父本：选择花完全展开，呈十字状，雄蕊花药完全成熟（花药很黄，裂开有花粉）的拟南芥作为父本。
　　（4）人工授粉：用镊子夹住雄蕊柄部取下，在去雄后的母本花柱头上轻轻擦拭数次，套好杂交袋，并做好标记（包括父本、母本、杂交日期等）。注意：授粉最好在上午10 点之前进行；母本花去雄后1～2 d 授粉皆可。
　　（5）观察记录：2～3 d 后，如果柱头正在发育膨大，则表明杂交成功（图1-2）。
　　五、注意事项
　　1．选择母本时，一定要选用花苞适中的花朵作为母本。花苞过小，可能无法授粉，也不便于后续操作；花苞过大，可能已经散粉而无法进行杂交。
　　2．母本去雄时，操作过程不要弄伤、弄折柱头及花茎，否则花将无法正常授粉、发育，最终无法得到杂交种子。
　　图 1-2　拟南芥杂交过程示意图粉、发育，最终无法得到杂交种子。
　　3．选择父本时，尽量选择较大、已经散粉但闭合的花苞，避免外界花粉的干扰而形成不知亲本来源的杂交后代。
　　六、实验结果与分析
　　1．记录出芽时间、长出真叶时间以及开花的时间。
　　2．统计杂交的成功率。
　　七、思考题
　　如果想使拟南芥尽快开花，如何调节培养条件？
　　实验二　rrg短根突变体的观察及遗传分析
　　一、实验目的
　　1．进行相对性状的观察，掌握判断显性性状和隐性性状的方法。
　　2．掌握质量性状的遗传分析方法和基本原理。
　　3．掌握拟南芥无菌苗的种植方法。
　　二、实验原理
　　1．显隐性的判定
　　两亲本杂交得到 F1后代，通过观察亲本、 F1植株的表型来判定性状的显隐性。本实验中， rrg突变体表现为短根表型，野生型表现为正常根表型。若 F1植株表现为正常根表型，则突变为隐性突变；若 F1植株表现为突变短根表型，则突变为显性突变。